- 刘凯胜;邱贤秀;王一飞;
目的:克隆获得人热休克蛋白90α(Hsp90α)基因,构建其原核表达载体,分离纯化重组蛋白,为Hsp90抑制剂的体外筛选奠定基础。方法:TRIzol Reagent法提取K562细胞总RNA,通过RT-PCR获得Hsp90α-cDNA。以该cDNA为模板PCR扩增Hsp90α基因,目的基因和质粒pET28a(+)经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接酶切片段,将重组DNA转化DH5α,酶切及测序鉴定重组体。将构建好的重组质粒转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG诱导,经条件优化后进行中试发酵、纯化以及Western blot鉴定。结果:原核表达载体pET28a(+)-Hsp90α成功构建,可在Rosetta(DE3)中正确表达,中试发酵收菌574g且表达产物以可溶性形式存在,纯化产物纯度为97%。结论:利用分子克隆技术建立了Hsp90α基因的原核表达和中试发酵的条件,为更深入地研究其在抗肿瘤治疗中的作用打下基础。
2011年03期 v.21;No.124 1-5页 [查看摘要][在线阅读][下载 727K] - 张伟;黄旭东;韩小波;任珊珊;王小柯;李艳艳;唐胜建;
目的:用FOXL2编码区片段构建酵母双杂交诱饵质粒并对诱饵质粒进行自激活活性及毒性检测。方法:PCR扩增FOXl2编码区DNA片段,克隆入pGBKT7质粒,转化至DH-5α大量扩增后提取质粒,经PCR、酶切和测序验证,再转化至Y187酵母菌株中用缺陷培养基筛选并进行自激活和毒性检测。结果:获得FOXL2基因1 137bp片段,并成功将人类正常和一突变型FOXL2编码区克隆入pGBKT7中,经检测在SD/-Trp/X-α-Gal单缺培养基平板上无蓝色菌斑出现,在SD/-Ade/-Trp培养基平板无生长。同时在SD/-Trp/Kana(20μg/ml)培养24h后测得菌液OD600≥0.8,说明重组诱质粒无自激活活性和酵母毒性,满足作为诱饵质粒的条件。结论:成功构建了正常及突变型的FOXL2酵母杂交诱饵质粒;为进一步利用酵母双杂交技术研究与FOXL2相互作用的蛋白打下坚实基础。
2011年03期 v.21;No.124 6-10页 [查看摘要][在线阅读][下载 557K] - 胡勇;丛延广;邱荣蓉;张云茹;林治华;
目的:构建伤寒沙门菌Ty2菌株菌毛亚单位bcfD基因敲除突变株。方法:利用交错PCR得到bcfD基因缺失且含其两侧翼序列的片段,将该片段与pMD 18-T连接,亚克隆到pYG4,电转入大肠埃希菌S17-1/λpir菌株,阳性菌株与受体菌伤寒沙门氏菌Ty2进行固相杂交后筛选。结果:成功获得敲除bcfD基因序列954bp的敲除突变株。结论:交错PCR有利于细菌基因精确敲除突变株的构建,bcfD基因敲除株的构建将为进一步研究该基因在伤寒沙门菌中的功能奠定了基础。
2011年03期 v.21;No.124 10-13页 [查看摘要][在线阅读][下载 206K] - 刘梦瑶;韩钰;何玲;蔡富强;王艳林;
目的:克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶2(OAZ2)功能基因,原核表达、纯化OAZ2蛋白并制备抗OAZ2多克隆抗体。方法:RT-PCR法从鼠黑色素瘤细胞总RNA中克隆OAZ2 cDNA后,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因。将OAZ2功能基因克隆入原核表达载体pET15b并原核表达。表达的蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,用SDS-PAGE和West-ern Blot分析鉴定。用纯化的OAZ2蛋白作为抗原免疫Bab/C小鼠以制备多克隆抗体,制备抗体用ELISA和Western Blot检测抗体滴度和特异性。结果:成功获得小鼠OAZ2 cDNA并构建出无需移码翻译的OAZ2功能基因。OAZ2功能基因在大肠杆菌BL21(DE3)中可诱导性高表达并能用Ni-NTA树脂高效纯化。用纯化蛋白免疫Bab/C小鼠制备的抗血清经ELISA检测有较高的多克隆抗体效价(>1:64 000),经Western blot鉴定可与纯化的OAZ2蛋白质特异性结合。结论:建立了鼠OAZ2蛋白原核表达和纯化技术,制备出高效价和特异性抗OAZ2多克隆抗体,为进一步研究OAZ2基因的功能奠定了基础。
2011年03期 v.21;No.124 13-16页 [查看摘要][在线阅读][下载 325K] - 孙敏;施青青;傅德智;阴彦辉;张亚妮;李碧春;
目的:探讨鸡胚胎干细胞(ESC)和精原干细胞(SSCs)在基因表达水平上的差异。方法:传至二代的ESC和SSCs,采用免疫荧光和碱性磷酸酶检测法联合鉴定其干细胞特性,RT-PCR方法检测两者相关基因的表达差异。结果:两种处于未分化状态时的干细胞基因表达存在差异:未分化的ESC表达基因GDF3基因和Nanog基因;SSCs表达特定基因c-kit、Cvh和Stra8基因。结论:两种干细胞在基因表达水平上有差异,为ESC与SSCs在基因水平上的鉴定提供参考依据。
2011年03期 v.21;No.124 16-19页 [查看摘要][在线阅读][下载 341K] - 林丽华;郭媛;庞浩;黄日波;
目的:改造大肠杆菌的代谢途径,使非生产菌株大肠杆菌具备产异丁醇的能力。方法:将乳脂乳球菌NIZO B1157的2-酮酸脱羧酶基因kdcA克隆到大肠杆菌中,使大肠杆菌产异丁醇;另外,采取两种方法过量表达alsS、ilvC、ilvD基因,增加前体物质酮酸的供应,以提高异丁醇的产量:一是与kdcA串联表达;二是在另一个相容质粒中表达。结果:大肠杆菌工程菌具备产异丁醇的能力,其中相关基因在一个质粒中串联表达的产量比其在两个相容质粒中共表达的产量高30倍,达到3g/L。结论:导入的酮酸合成途径与醇类生产途径结合,能使非生产菌株大肠杆菌生产异丁醇,并且单质粒表达代谢途径相关基因的效果优于双质粒表达。
2011年03期 v.21;No.124 19-23页 [查看摘要][在线阅读][下载 574K] - 刘晓飞;余榕捷;王静静;苏航;黄霖;陈建苏;
目的:制备带有穿膜肽的重组蛋白PTD-Sox2并对其活性进行鉴定。方法:通过将Sox2基因与穿膜肽基因PTD融合,利用原核表达载体pKYB进行表达,用Ni柱制备、纯化融合蛋白;用Western blot对其进行鉴定;用FITC标记PTD-Sox2,与CHO细胞孵育,检测其穿膜能力;用FRET法检测转录因子Sox2结合目的DNA的活性。结果:构建了带有穿膜肽重组PTD-Sox2的原核表达菌,制备并纯化PTD-Sox2,对其活性鉴定。结论:PTD-Sox2能够穿过细胞膜与核膜,进入细胞核内,穿膜效率为40.86%,并且可与目的DNA进行特异结合,为蛋白体外诱导iPS的产生奠定基础。
2011年03期 v.21;No.124 23-29页 [查看摘要][在线阅读][下载 1103K] - 王俊卿;付烈;周稳;熊平;汪浩勇;
目的:研究在大肠杆菌中能够有效抑制α-synuclein异常折叠的小肽,在人神经母细胞瘤SH-SY5Y中的抑制作用。方法:基于a-Syn疏水区域设计的5种透膜小肽在大肠杆菌中能够有效抑制α-synuclein异常折叠;构建真核表达质粒CMV-SynGFP-IRES-Pn并转入SH-SY5Y细胞,通过测定细胞荧光强度分析小肽抑制α-synuclein异常折叠情况,由此评价大肠杆菌筛选系统确定的小肽在真核SH-SY5Y细胞中的有效性。结果:在大肠杆菌中能有效抑制α-Syn(129A)异常折叠的三种小肽R7P1、R7P3、R7P4,在SH-SY5Y中的作用效果也十分明显,分别比对照肽ASI1D提高了114%、98%和98%。对于α-Syn(53T),R7P1和R7P2在SH-SY5Y中分别比对照提高了90%和44%;然而在两种细胞中,5种透膜小肽对野生型α-Syn(WT)的作用与对照相比差距不明显。
2011年03期 v.21;No.124 29-33页 [查看摘要][在线阅读][下载 390K] - 朱卫华;周燕;练翠翠;李敏智;陈秋云;欧忠平;许化溪;
目的:探究非水溶性的四苯基卟啉氯化锰[(TPP)MnCl]与小牛胸腺DNA(ctDNA)的相互作用方式及机理。方法:借助紫外-可见光谱、荧光光谱和电化学等手段研究了(TPP)MnCl与ctDNA相互作用的过程。结果:两者作用后,(TPP)MnCl的紫外-可见光谱在Soret带减色30%;EB-DNA体系的荧光猝灭;(TPP)MnCl的循环伏安也明显变化。实验测得(TPP)MnCl与ctDNA的表观结合常数为9.3×105L.moL-1。结论:在实验条件下,(TPP)MnCl与ctDNA以静电结合方式相互作用。
2011年03期 v.21;No.124 33-36页 [查看摘要][在线阅读][下载 299K]
- 谷铁军;张凤羽;段冶;卫巍;姜春来;吴永革;孔维;
目的:通过一系列短引物拼接合成狂犬病毒糖蛋白单链抗体基因Fv57。方法:采用SOE-PCR的方法,利用多条短的寡核苷酸引物,经过6轮PCR,拼接合成800bp左右的狂犬病毒糖蛋白单链抗体基因Fv57,并利用此方法修正了上述PCR过程中产生的多处突变,从而获得正确的单链抗体基因序列。结果:采用SOE-PCR法合成的基因序列经测序及酶切鉴定,与预期结果一致。结论:成功地利用SOE-PCR法合成了狂犬病毒糖蛋白单链抗体基因Fv57,为其下一步构建原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达奠定基础。
2011年03期 v.21;No.124 36-39页 [查看摘要][在线阅读][下载 398K] - 张智毓;姚庆智;闫伟;
目的:蒙古口蘑是一种著名的野生食用菌。为了辨别蒙古口蘑与其相似的草原蘑菇种及分离菌株的真伪。方法:采用ITS序列分析方法对从内蒙古地区采集的子实体和纯培养菌株进行分子鉴定。结果:在20个供试材料中,从呼伦贝尔草原采集的4个子实体(来源于不同地区)中有2个属于蒙古口蘑,从子实体分离得到的纯培养物中有2个为蒙古口蘑菌株;在呼伦贝尔地区购买的蘑菇干品和冷冻品都属于蒙古口蘑;从锡林郭勒草原的不同地区采集分离得到的10株纯培养物中有6株为蒙古口蘑菌株。结论:在呼伦贝尔地区和锡盟地区都有蒙古口蘑存在,而且从不同地区采集的蒙古口蘑亲缘关系比较近。
2011年03期 v.21;No.124 40-43页 [查看摘要][在线阅读][下载 318K] - 金一帮;周洋;王俊华;吐尔洪江·吐逊;魏晓丽新疆医科大学第一附属医院新疆包虫病基础医学重点实验室;张志;张传山新疆医科大学第一附属医院新疆包虫病基础医学重点实验室;李亮新疆医科大学第一附属医院新疆包虫病基础医学重点实验室;林仁勇新疆医科大学第一附属医院新疆包虫病基础医学重点实验室;温浩;
目的:观察细粒棘球蚴囊液对体外培养BALB/c小鼠脾细胞白介素(IL)-17和Smad2基因表达的影响。方法:制备小鼠脾细胞悬液,接种于48孔培养板中进行培养,以不加任何干预为对照组,囊液处理组为实验组。定时取样提取总RNA,经反转录成cDNA后用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测IL-17和Smad2基因的表达。结果:小鼠脾细胞IL-17表达在囊液处理6h和12h后升高(1.000±0.207 VS 3.672±0.746和1.000±0.154 VS 5.525±0.843),差异有统计学意义(P<0.05);小鼠脾细胞Smad2表达在培养1h后升高(1.000±0.077 VS 2.069±0.098)在12h后降低(1.000±0.110 VS 0.247±0.011),差异有统计学意义(P<0.05);协同分析发现IL-17基因与Smad2基因的表达变化呈现负相关(P<0.01),相关系数r=-1。结论:细粒棘球蚴囊液对小鼠脾细胞IL-17和Smad2基因的表达具有上调作用,推测其可能与宿主抗棘球蚴感染的机制有关。
2011年03期 v.21;No.124 43-47页 [查看摘要][在线阅读][下载 450K] - 王希菊;李剑凤;孙丽霞;艾丽静;刘克玲;王克波;王红洁;薛彤彤;王晶翼;
目的:在毕赤酵母中实现了KGF的高效表达,并初步建立了生物学活性检测方法。方法:合成5’端缺失69个核苷酸的KGF基因序列,克隆入pPIC9并转化毕赤酵母菌株GS115中,经诱导表达。发酵液上清采用脱盐层析和阳离子交换层析进行分离纯化。利用貂肺上皮细胞(Mv-1-Lu)检测其生物学活性。结果:表达水平达到了110mg/L发酵液;表达产物经一步离子交换层析就能得到有效分离,总收率在50mg/L发酵液以上;纯化的rhKGF生物学活性与KepivanceTM相当。结论:rhKGF制备工艺和检测方法的建立将为该因子的规模化生产和进一步的临床应用提供良好基础。
2011年03期 v.21;No.124 47-50页 [查看摘要][在线阅读][下载 488K] - 仇燕;李朝炜;苗芳;
目的:探讨聚乙二醇诱导鸡红细胞融合最适条件。方法:以鸡红细胞为材料,聚乙二醇为诱导剂,从细胞密度、融合温度、聚乙二醇浓度及反应时间进行单因素实验,并设计3因素3水平的正交实验计算细胞融合率。结果:鸡红细胞融合的最佳条件是:细胞密度为2×106个/ml,聚乙二醇浓度为35%,反应温度为35℃,反应时间40min。结论:在该条件下,细胞融合率最高达33.06%。
2011年03期 v.21;No.124 50-53页 [查看摘要][在线阅读][下载 522K] - 徐枫;王和平;孙庆林;张雄杰;
目的:为城市屠宰场牛羊胃容物类的生物垃圾型可再生资源的潜在工业化开发应用(城市无害鲜生物垃圾变废为宝的低碳生物循环经济工程)提供了部分可靠科学依据。方法:M-112木霉菌固态发酵羊胃容物的粗酶提取液,经20~60%饱和度的硫酸铵粗分级分离、Sephadex G-25脱盐、Sephadex G-150到Sephadex G-100分子筛顺序纯化,通过蛋白质测定、酶活测定、SDS-PAGE和底物-PAGE电泳等。结果:制备到一种分子量约为64.7kDa的电泳纯木聚糖酶,其回收率为5.59%,纯化倍数10.43,比活力为253.36IU/mg。纯化出的木聚糖酶,经性质研究表明,其Km=11.20g/L,Vmax=0.70μmol/min;最适温度为65℃,最适pH为6.0,该酶在中温条件下稳定性好,在酸性至弱碱性(pH3.0~8.0)条件下稳定性好。结论:采用改良的凝胶色谱技术,首次纯化出木霉菌固态发酵羊胃容物所产的木聚糖酶。
2011年03期 v.21;No.124 54-60页 [查看摘要][在线阅读][下载 692K] - 李新;孙晓;李悦佳;高霞;杜崇旭;
目的:从运城盐湖中分离获得中度嗜盐菌,并对其进行分离鉴定及酶学特性研究。方法:采用淀粉底物平板法获得高产胞外淀粉酶的嗜盐菌株LY9。16S rRNA序列分析,结合形态学和生理生化特征分析对其进行分类鉴定。研究不同物理化学因素对淀粉酶活性的影响。结果:系统发育分析表明该菌为Halobacillus属成员,鉴定并命名为Halobacillus sp.LY9,为中度嗜盐菌。该淀粉酶最适作用温度和pH值分别为60℃和8.0,同时在较宽pH范围内(4.0~12.0)保持高活力,表现出了较强的抗酸碱能力。Cu2+可明显抑制该酶活性,其它金属离子则基本无影响;该酶不受EDTA的抑制,表明该酶不属于金属蛋白酶,但SDS却能使酶活明显降低。结论:LY9的分离鉴定及其淀粉酶特性研究对促进运城盐湖生物资源的开发利用具有重要意义。
2011年03期 v.21;No.124 60-63页 [查看摘要][在线阅读][下载 429K]
- 罗淑敏;柯长洪;蔡继业;李敏娟;
目的:汉防己甲素和顺铂联合作用乳腺癌细胞,来提高癌细胞对顺铂的敏感性。方法:运用原子力显微镜对乳腺癌细胞表面的超微结构进行表征;MTT法和流式细胞术检测细胞的生长抑制率和细胞周期变化。结果:顺铂和汉防己甲素分别作用乳腺癌细胞48h IC50值为26.33μmol/l和5.6μmol/l;联合用药组的IC50值为汉防己甲素2.5μmol/L和顺铂13.32μmol/l,在低浓度的联合用药作用乳腺癌细胞24h细胞膜表面结构被破坏,产生孔洞,作用48h被严重破坏使细胞周期在S比例增加为51.7%±0.30%。结论:提高了癌细胞对抗癌药物的敏感性,联合用药通过改变了细胞膜的结构对癌细胞进行有效杀伤,抑制肿瘤细胞生长。
2011年03期 v.21;No.124 64-69页 [查看摘要][在线阅读][下载 1074K] - 张月娟;张琨;万一;
目的:优化已构建的重组hCu,Zn-SOD改构体基因工程菌的发酵培养基,提高重组hCu,Zn-SOD改构体活性蛋白产量。方法:单因素实验筛选发酵培养基的碳源和氮源,Plackett Burman设计筛选影响hCu,Zn-SOD活性的重要影响因子,最陡爬坡实验逼近重要影响因子的hCu,Zn-SOD活性的最大响应区域,Box-Behnken及响应分析法进行回归分析。结果:重组hCu,Zn-SOD改构体发酵培养基重要影响因子的最优取值为:酵母提取物7.464 6g/L,NaNO30.712 9g/L,Na2HPO4.12H2O30.487 6g/L,KH2PO44.183 0g/L,优化后的hCu,Zn-SOD活性是1 470 700U/L,较初始培养基提高了1.04倍。结论:响应面法优化重组hCu,Zn-SOD的发酵培养基提高了hCu,Zn-SOD的活性和产量,为重组hCu,Zn-SOD的工业化生产提供依据。
2011年03期 v.21;No.124 69-73页 [查看摘要][在线阅读][下载 331K] - 夏西木卡玛尔·买买提;王永垒;吾满江·艾力;
目的:为了提高1,4-丁二醇的附加值和开发新型的生物可降解材料。方法:以钛酸四丁酯为催化剂通过酯化缩聚合成了聚丁二酸丁二醇酯(PBS)。考察了醇酸摩尔比、催化剂用量、反应温度、反应时间等因素对酯化率的影响。结果:醇酸物质的量比为1∶1.2,催化剂用量为0.6%(质量百分含量),反应温度220℃,反应时间6h,酯化率可达98.7%,平均分子量和分子量分布分别为:Mn=182197,Mw/Mn=1.626406。利用红外谱(IR)、凝胶渗透色谱(GPC)对产物进行了表征确认。
2011年03期 v.21;No.124 74-76页 [查看摘要][在线阅读][下载 323K] - 王爽;张惠文;叶淑红;徐明恺;
目的:筛选还原型谷胱甘肽(GSH)高产菌株并优化其提取工艺。方法:从中科院沈阳应用生态研究所菌种保藏室的酵母菌库中筛选GSH高产的酵母菌,改进培养基组分,提高胞内GSH含量,并优化热水抽提和乙醇提取两种方法,提高提取液中GSH含量。结果:筛选获得一株酿酒酵母Y,其胞内GSH含量9.60 mg/g,培养基改良后,胞内GSH含量又提高了34.8%。通过单因素和正交试验确定热水抽提法最优提取条件为:料液比1∶3,pH 2.0,在90℃水浴中,抽提10min,GSH的产量可达14.27mg/g干菌体。结论:添加氨基酸和葡萄糖都有利于酵母菌体的生长和GSH合成。热水抽提法较乙醇提取法相比,提取效果好、无污染、操作简单,为后续的分离纯化工作奠定基础。
2011年03期 v.21;No.124 76-82页 [查看摘要][在线阅读][下载 606K] - 王伟平;陈维;韩凤云;杜予民;
目的:研究蓝色犁头霉产壳低聚糖分批发酵动力学的模型。方法:在10L发酵罐中,将蓝色犁头霉分批发酵培养,对蓝色犁头霉菌丝体生长、产物形成和基质消耗的实验数据进行分析,根据Logistic和Luedeking-Piret方程分别建立蓝色犁头霉发酵过程菌体生长、壳低聚糖生成和基质消耗的动力学数学模型,并利用1stOpt软件对模型参数进行非线性曲线拟合。结果:研究得到了菌体生长、产物合成及基质消耗的动力学模型及参数,模型的拟合度分别为0.994、0.986、0.992。结论:研究表明蓝色犁头霉多糖合成和菌体生长呈生长偶联型,模型计算值与实验值有良好的拟合性,模型准确度较高。
2011年03期 v.21;No.124 82-84页 [查看摘要][在线阅读][下载 298K] - 熊勇;熊扬波;杨青松;
目的:研究药用植物密蒙花总黄酮提取工艺及其抗氧化性能。方法:在单因素试验的基础上,采用正交试验设计对总黄酮提取工艺进行优化,并研究密蒙花黄酮类化合物对羟自由基的清除作用和对羟自由基诱发卵磷脂脂质过氧化的抑制作用。结果:最佳提取工艺即以60%乙醇为提取剂、提取物料比为1∶30、提取温度为70℃、提取时间为3h,总黄酮的提取率为16.72%。结论:试验结果表明提取工艺合理,总黄酮提取率高,密蒙花总黄酮提取液具有很好抗氧化性能。
2011年03期 v.21;No.124 85-87页 [查看摘要][在线阅读][下载 296K] - 于德水;高娃;沙长青;张淑梅;高继国;
目的:BS-17是内生细菌,对番茄灰霉病菌、叶霉病菌和枯萎病菌具有显著抑菌活性,为了跟踪研究野生型菌株BS-17在番茄根围和叶围的定殖情况,构建了1株带有黄绿荧光蛋白基因标记的生防菌株BS-17A。方法:采用NYD连续培养的方法和平皿抑菌试验的方法对工程菌株的遗传稳定性和抑菌活性进行了初步研究。结果:该工程菌在无选择压力培养基中连续培养50h,质粒遗传稳定性为94%,对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、叶霉病菌Cladosporium fulvum和枯萎病菌Fusarium oxysporum的抑制作用与野生菌无显著差异,平皿抑菌率分别为85.5%、86.5%和89.8%。结论:该工程菌具有较强的遗传稳定性和抑菌活性。
2011年03期 v.21;No.124 88-90页 [查看摘要][在线阅读][下载 317K] - 吴皓琼;牛彦波;殷博;甄涛;曹亚彬;郭立姝;
目的:探讨PGPR植物促生肥在大豆上的应用效果。方法:采用田间小区随机试验及大区简单对比处理、拌种及作种肥施用方式进行,生育期调查,对产量及产量构成因子进行比较分析。结果:大区对比试验,亩施100ml液体菌剂或1.0kg粉剂拌种,与常规施肥的对照相比,大豆早熟2~3d,根瘤数增加3.0~26.8个/株,百粒重增加0.2~0.8g,产量提高3.2%~12.7%。除1个试验点因低温干旱增产不明显外,其余试验点增产率都超过6%。其中,液体拌种平均增产9%,固体粉末作种肥平均增产9.3%,与小区试验结果基本相吻合。结论:PGPR植物促生肥在大豆上应用效果稳定,增产显著,具有实际推广应用价值。
2011年03期 v.21;No.124 90-94页 [查看摘要][在线阅读][下载 174K]