- 姜琦;郑强;吴启康;国会艳;
[目的]对在白桦转录组中发现的4个WRKY转录因子进行分析及基因克隆,并通过生物信息学分析这4个WRKY蛋白。[方法]利用PCR技术扩增4个基因并将其构建到T载体上。同时,利用在线网站分析这4个WRKY基因的理化性质及功能。[结果]发现这4个白桦WRKY基因编码311～335个氨基酸,分子量在34. 39～37. 70 k Da之间,均属于不稳定的亲水性蛋白质,并且为无跨膜结构区的核内蛋白。保守结构域分析发现这4个白桦WRKY基因中均含有一个高度保守的WRKY结构域。通过与拟南芥WRKY蛋白的系统树构建,分析这4个WRKY基因的功能。[结论]成功克隆出4个白桦WRKY基因,为后期深入分析这4个白桦WRKY基因的功能提供了前期研究基础。
2019年05期 v.29;No.174 411-419+433页 [查看摘要][在线阅读][下载 2600K] - 刘子矜;于孟斌;徐志卿;杨予涛;
[目的]旨在原核表达转录因子LRF的POZ结构域,纯化获得GST-POZ融合蛋白。[方法]以SD大鼠海马组织c DNA为模板,利用PCR扩增带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的LRF基因的POZ结构域,并将其插入到原核表达载体p GEX-4T-1中,将构建成功的p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导融合蛋白表达,再利用MagneGST particles亲和纯化GST-POZ融合蛋白,最后通过Western Blot鉴定融合蛋白。[结果]p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒构建成功;在37℃条件下,浓度为0. 2 mmol/L的IPTG诱导7 h能够使重组蛋白大量表达,经MagneGST particles纯化后的GST-POZ重组蛋白能够被识别LRF的抗体特异性识别。[结论]纯化后的GST–POZ重组蛋白能够用于后续的生物学研究。
2019年05期 v.29;No.174 420-425页 [查看摘要][在线阅读][下载 307K] - 郑阳臣;尹丽娟;刘大才;
[目的]旨在构建表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组鸡痘病毒。[方法]使用overlap PCR进行表达载体质粒的构建,使用菌液PCR和测序技术进行了鉴定;使用鸡胚成纤维细胞作为重组鸡痘病毒同源重组的介质,尝试了可能影响重组鸡痘病毒构建的不同条件;最后使用PCR和Western Blot方法对重组病毒进行了鉴定。[结果]将人工合成的痘苗病毒早晚期启动子SP与绿色荧光蛋白基因一同插入到鸡痘病毒载体质粒的多克隆位点,挑取LA平板上的重组子,菌液PCR及测序验证鉴定结果为阳性;利用重组质粒转染被野生鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞制备重组病毒,利用倒置荧光显微镜观察到含有重组病毒的在激发光下呈绿色的细胞;改进重组质粒转染的条件以达到更好的重组病毒包装成效,研究得出被野生痘病毒感染的细胞进行重组质粒传染制备重组病毒的效率是用野生痘病毒感染已转染重组质粒的细胞的6倍,且感染用野生病毒滴度高时重组病毒的制备效果更好;最后,用PCR方法和Western Blot方法对重组病毒进行鉴定,鉴定结果为阳性。[结论]成功构建了表达GFP的重组鸡痘病毒。
2019年05期 v.29;No.174 426-433页 [查看摘要][在线阅读][下载 1049K] - 阳元娥;李永莲;张媛媛;周春晖;
[目的]实现重组大肠杆菌高效合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)。[方法]构建表达谷氨酸脱羧酶的基因工程菌Escherichia coli p ET-GAD,对催化工艺进行初步优化,实现高效催化L-谷氨酸脱羧反应合成GABA。[结果]在谷氨酸脱羧酶的表达过程中,维生素B6盐酸吡哆醇(PN)可以替代5-磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶补给,提高工程菌E. coli p ET-GAD的催化活力。在50 m L反应体系中,重组细胞浓度为8 mg/m L,底物浓度为200 mmol/L,在35℃、p H 4. 4条件下反应2 h,L-谷氨酸的转化率> 98%。为了提高GABA的生产效率,采用谷氨酸/谷氨酸钠分批补料方式控制反应过程中的p H值,GABA的最终浓度达到247 g/L。[结论]重组大肠杆菌可以高效催化合成γ-氨基丁酸,为基因工程菌工业化制备GABA提供实验依据。
2019年05期 v.29;No.174 434-440页 [查看摘要][在线阅读][下载 456K] - 张慧敏;王君;刘美君;黄凤;李含含;戴周彤;张子健;李慧;李佳蓬;项园;廖兴华;
[目的]探讨MKL1和CAAP1对胃癌细胞凋亡的影响及其分子机制。[方法]蛋白质印迹和实时荧光定量PCR检测MKL1、CAAP1过表达效果;蛋白质印迹、流式细胞术、自噬检测试剂盒检测细胞的自噬和凋亡情况;荧光素酶报告基因活性测定、染色质免疫共沉淀验证MKL1和CAAP1基因启动子的结合。[结果]在MGC80-3细胞中过量表达MKL1后,凋亡抑制蛋白CAAP1的mRNA和蛋白水平与对照组相比均上调(P <0. 05),自噬标记基因LC3BII表达升高(P <0. 05),促凋亡蛋白Caspase3表达降低(P <0. 05)。敲降MKL1,Caspase3蛋白表达升高(P <0. 05)。敲降CAAP1,Caspase3蛋白表达升高(P <0. 05)。过表达CAAP1拮抗敲降MKL1,LC3BII蛋白表达下降,Caspase3蛋白表达升高(P <0. 05)。荧光素酶活性分析以及染色质免疫共沉淀分析结果表明MKL1促进CAAP1基因的转录活性。[结论]MKL1可通过上调CAAP1的表达进而促进胃癌细胞的自噬并抑制细胞凋亡。
2019年05期 v.29;No.174 441-450页 [查看摘要][在线阅读][下载 2195K]
- 荣成博;牛玉蓉;刘宇;杨丽;王月雪;徐同雷;王守现;
[目的]为了快速、准确地对热带小奥德蘑JZB2115055进行鉴定和保护,该研究开发了该菌的序列特异性扩增(SCAR)标记。[方法]采用26个ISSR引物对19个小奥德蘑属菌株进行PCR扩增,以引物P826扩增时,JZB2115055在700 bp～1 000 bp之间出现了一条特异条带,获得此条带的DNA序列并设计特异性引物对P826-1-2XF/R。[结果]以19个小奥德蘑DNA为模板,P826-1-2XF/R为引物在JZB2115055中能够特异性地扩增出2条条带,长度分别为431 bp、537 bp;该引物在2～19号菌株中扩增不出目的条带或者扩增条带在2 000～5 000 bp之间。[结论]开发了热带小奥德蘑JZB2115055的SCAR标记,能够在该菌中特异性地扩增出431 bp和537 bp大小的条带,而其他18株菌株不能扩增出特异条带,此标记能够快速、准确地进行该菌的鉴定和保护。
2019年05期 v.29;No.174 451-455+440页 [查看摘要][在线阅读][下载 564K] - 贾洋洋;张蕊;刘阳;刘忠渊;
[目的]原核表达及制备重组光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂(Ap Serpin-FA72),探索包涵体最优复性条件与最适酶反应条件。[方法]采用超声破碎获得大量包涵体,通过包涵体的洗涤、包涵体的溶解方法对包涵体进行纯化,获得高纯度的包涵体进行复性液成分与复性方法的摸索。测定Trx A-Ap Serpin-FA72对胰蛋白酶的IC50、最适反应p H和最适反应温度。[结果]在32℃、180 r/min、0. 4 mmol/L IPTG浓度下以沉淀形式表达大量蛋白,通过包涵体复性在含有L-精氨酸复性液中获得有生物活性的Trx A-Ap Serpin-FA72,对胰蛋白酶的IC50为0. 48μmol/L,p H在7～9,温度在60℃时有较高的抑制活性。[结论]L-精氨酸是复性液中重要的组成部分,复性的重组蛋白Trx A-Ap SerpinFA72对胰蛋白酶有较强的抑制能力,是一种热稳定较好的弱碱性胰蛋白酶抑制剂。
2019年05期 v.29;No.174 456-462+469页 [查看摘要][在线阅读][下载 710K] - 王朝江;李慧;王世清;高春燕;李聪;
[目的]比较不同DNA提取前处理方法对太岁表层组织细菌结构的影响。[方法]设水浸提(SO1)、浸提后热溶解(SO2)、直接热溶解(SO3)与微孔过滤结合的3种处理法,高通量测序。[结果]SO1、SO2、SO3的Shannon指数均接近4. 44,OTU数目均接近1 677个,共有OTU 807个,序列占比95. 65%。所含细菌在各分类水平上数目相近,各涉及约20个门、200多个属,优势类群集中在未分类属(unclassified)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)和Povalibacter 4个属,占比之和超过了60%。除未分类属外的三个属,均各有一种超高占比OTU支撑。假单菌属占比最高,各处理均为21%左右。[结论]3种前处理方法测得的细菌菌群结构,均表明太岁表层组织中细菌种类多,分布不平衡,假单胞菌属是占比21%的最优势属。
2019年05期 v.29;No.174 463-469页 [查看摘要][在线阅读][下载 230K]
- 倪卓;朱进普;何勇;刘楠;
[目的]引入界面增强剂磺化聚醚醚酮,合成新型聚醚醚酮/磺化聚醚醚酮/羟基磷灰石三元复合材料,研究该材料对成骨细胞MG-63氧化作用影响。[方法]将成骨细胞MG-63和各材料共同培养,测量材料对细胞产生丙二醛和活性氧化自由基水平,通过扫描电镜观察三元复合材料微观结构。[结果]三元复合材料上成骨细胞MG-63产生的丙二醛和活性氧化自由基浓度低于其他材料,HA质量百分比达到30%时,成骨细胞MG-63产生的丙二醛和活性氧化自由基浓度与在模拟人体正常生长条件下的数据接近,统计量P> 0. 05,氧化应激作用差异相对不明显,微观下该材料具备类骨的微孔结构和孔隙。[结论]该材料对成骨细胞MG-63氧化作用低于聚醚醚酮/羟基磷灰石材料,类骨的微孔结构能够增加细胞接触面积和有利于营养运输与骨诱导作用。
2019年05期 v.29;No.174 470-477页 [查看摘要][在线阅读][下载 2283K] - 得丽扎尔·热合曼;刘丹;孙素荣;李轶杰;
[目的]比较重组乳酸乳球菌不同途径发送HPV16E7 shRNA的抗肿瘤效果。[方法]通过实时定量PCR技术筛选出抑制Si Ha细胞中E7基因表达的shRNA片段并构建至乳酸乳球菌质粒p MG36e-RFP中。PCR鉴定获得重组乳酸乳球菌正确后分别通过滴鼻、静脉注射和瘤内注射途径发送到C57BL/6小鼠体内后,检测荷瘤小鼠的生存周期及体内肿瘤的生长大小。[结果]成功构建针对HPV16E7的shRNA干扰表达的重组乳酸乳球菌,肿瘤注射后32 d,鼻腔发送途径组小鼠肿瘤大小约为6. 49±1. 60 cm3,静脉注射组肿瘤大小为4. 49±1. 16 cm3,瘤内注射组肿瘤大小为1. 89±0. 52 cm3,至肿瘤注射60d时,瘤内注射组有3只存活。[结论]瘤内和静脉注射表达shRNA重组乳酸乳球菌均能抑制小鼠体内肿瘤的生长,其中瘤内途径优于静脉注射。
2019年05期 v.29;No.174 478-484页 [查看摘要][在线阅读][下载 489K] - 赵彩红;王家敏;李自良;王美皓;臧荣鑫;马忠仁;乔自林;
[目的]为筛选适应于MDCK细胞大规模培养的最佳培养基并揭示其代谢动力学规律。[方法]选取商业化的培养基DMEM(试验组A)、EMEM(试验组B)、MEM(试验组C)、M199(试验组D)、DMEM/F12(试验组E)及DMEM:EMEM复合培养基(试验组F)用于MDCK细胞传代培养,研究不同培养基对MDCK细胞生长特性的影响,分析MDCK细胞生长过程中葡萄糖(Gluc)、乳酸(Lac)、谷氨酰胺(Gln)和氨(NH4+)的代谢情况,并进一步进行细胞工厂的培养验证。[结果]结果表明MDCK细胞均能在试验组A、B、E、F四种培养基中生长,其最大增殖浓度E> A> F> B,差异显著(P <0. 05);倍增时间B> F> A> E,差异显著(P <0. 05);细胞比生长速率E> A> F> B,差异不显著(P> 0. 05)。不同培养基培养MDCK细胞对数生长期平均葡萄糖比消耗速率、谷氨酰胺比消耗速率及氨比生成速率差异均不显著(P> 0. 05),乳酸比生成速率差异显著(P <0. 05)。在试验组A和E培养基中细胞能实现高密度增殖,再将其进行细胞工厂扩大培养验证,发现两种培养基在培养48 h时均能达到单层致密,且细胞密度均达到8. 0×10~8/cells以上,差异不显著(P> 0. 05)。[结论]综合研究结果及规模化生产成本因素,采用DMEM培养基(试验组A)培养MDCK细胞,其最大增殖浓度达到6. 4×10~5/m L,倍增时间为22. 835 h,比生长速率为0. 558,可进行大规模培养,为工业化生产提供依据。
2019年05期 v.29;No.174 485-491页 [查看摘要][在线阅读][下载 788K] - 周艳;林中瑞;张聪;赵丹丹;
[目的]为了获得猴头菌多糖的最佳硫酸化修饰条件,提高猴头菌硫酸化多糖硫酸基团的取代度。[方法]采用单因素比较氯磺酸-吡啶摩尔比、反应温度和反应时间对猴头菌硫酸化多糖取代度的影响,利用响应面法对各因素的最佳水平以及各因素之间的交互作用进一步研究。[结果]猴头菌多糖的最佳硫酸化修饰条件为:氯磺酸-吡啶摩尔比为1:4、反应温度为59℃、反应时间为2. 6 h,取代度为0. 457,与模型的预测值基本相符。[结论]响应面法优化得到猴头菌多糖的硫酸化修饰条件参数准确,该模型可以用于猴头菌多糖硫酸化修饰条件的优化。
2019年05期 v.29;No.174 492-497页 [查看摘要][在线阅读][下载 357K]