- 王海禄;李杰;尹俊;
[目的]通过CRISPR/Cas9系统构建雪兔Corin基因编辑载体。[方法]通过在线CRISPR设计工具设计2个靶点,退火制备sgRNA双链,用BbsⅠ酶得到线性p X330载体后,经重组酶连接得到重组质粒。将重组质粒转化到DH5α感受态细胞,再对其进行PCR鉴定及测序比对分析。[结果]通过特异性扩增以及测序结果表明sgRNA准确地连入载体,插入序列无突变,与预期序列高度一致,重组子阳性率为100%。[结论]成功构建了雪兔Corin基因敲除载体,为进一步利用CRISPR/Cas9技术进行雪兔Corin基因编辑工作提供了研究基础。
2019年02期 v.29;No.171 103-105+204页 [查看摘要][在线阅读][下载 216K] - 贺欣薇;郑敏;胡安东;杨颖;周碧君;程振涛;文明;
[目的]探究NF-κB对DEV增殖是否有影响。[方法]以NF-κB1基因作为靶基因,设计并构建4个不同p GPU6/GFP/Neo shRNA表达载体,通过荧光显微镜法观察转染后细胞荧光密度和RT-PCR检测转染细胞NF-κB1基因转录水平以筛选最佳干扰质粒,分3种不同组别进行干扰实验后,以荧光定量PCR法检测DEV-NP基因表达变化。[结果]所构建的重组质粒p GPU6/GFP/Neo-NF-κB1-2对细胞NF-κB1基因的干扰效率最高,可达78. 77%;除先感染后干扰组对DEV增殖影响不大外,先干扰后感染组与同时感染和干扰组均对DEV增殖呈现出一定的抑制作用,其中先干扰后感染组在第72 h时的沉默效率最高,可达78%,而同时感染和干扰组于第48 h时的沉默效率最高,可达82%。[结论]RNA干扰下调NF-κB1基因会抑制DEV增殖。
2019年02期 v.29;No.171 106-110+160页 [查看摘要][在线阅读][下载 411K] - 陈梦瑶;冯超越;南天豪;陈星辉;冯雨彤;朱振洪;
[目的]克隆黄瓜Cu/Zn-SOD基因,并利用大肠杆菌进行可溶性表达、纯化及活性测定。[方法]采用Trizol法提取黄瓜表皮的总RNA,然后设计特异性引物,通过RT-PCR技术克隆获得黄瓜Cu/Zn-SOD基因。该基因与p GEX2T载体相连后,转化大肠杆菌BL21(DE3),摸索可溶性表达方法。利用GST亲和层析方法纯化目标蛋白,SOD酶活性测定采用邻苯三酚法。[结果]成功地克隆了全长为459 bp的黄瓜Cu/Zn-SOD基因,编码152个氨基酸。Protein Blast分析表明其结构域中分别包含Cu2+、Zn2+结合位点,为典型的Cu/Zn-SOD酶。目标蛋白可溶性表达条件是16℃、0. 1 mmol/L IPTG诱导20 h。SDS-PAGE分析表明GST亲和层析成功地获得重组黄瓜Cu/Zn-SOD。活性测定表明两次纯化的蛋白样品SOD酶活力分别为2 328. 9 U/m L、2 144. 7 U/m L。[结论]从黄瓜表皮中克隆获得Cu/Zn-SOD基因,该基因在大肠杆菌系统中获得可溶性表达,纯化后的重组蛋白具有较高的SOD酶活力。
2019年02期 v.29;No.171 111-115页 [查看摘要][在线阅读][下载 199K] - 蒋晓芳;周波;杨江科;
[目的]实现耐热α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中的高效表达,并初步研究其酶学性质。[方法]克隆来源于埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)的α-半乳糖苷酶基因TEgal,构建p AO815-TEgal重组表达载体,采用DNS法测定其水解活性及酶学性质;通过薄层层析研究其水解底物谱;并构建TEgal基因多拷贝表达框,实现了该基因的高效表达。[结果]TEgal对棉籽糖水解活性最高9. 5 U/m L,最适温度75℃,最适pH值3. 5; Na~+、K~+对TEgal有促进作用,Mg~(2+)、Co~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)均能抑制酶活,多拷贝重组表达菌株活性最高为22. 4 U/m L。[结论]成功构建耐热α-半乳糖苷酶高效表达菌株,通过提升基因剂量将酶活和蛋白含量提高了135%和356%。
2019年02期 v.29;No.171 116-121+115页 [查看摘要][在线阅读][下载 404K] - 李泽民;赵林;邓栩文;祝贺;邱创楠;温碧燕;刘梦苗;李黄金;
[目的]构建靶向EGFR二聚化界面的单链抗体。[方法]构建单链抗体的基因并进行密码子优化,克隆于表达载体p GAPZα-A和毕赤酵母X-33。镍柱纯化目的蛋白,并对EGFR高表达细胞A431和EGFR正常表达细胞NIH-3T3进行体外抑制分析和抗磷酸化分析。[结果]纯化获得了分子量大小约29. 0 k Da的EGFR dimer Sc Fv蛋白。在48h体外抑制实验中,534 nmol/L EGFR dimer Sc Fv对A431和NIH-3T3的抑制率分别为34. 92±1. 30%和5. 89±0.46%,抑制作用与母本抗体相似。Western Blotting分析表明,EGFR dimer Sc Fv能显著抑制A431细胞EGFR磷酸化,而对NIH-3T3细胞显著无抑制作用。[结论]初步验证了靶向EGFR二聚化界面的单链抗体作为新型抗体药物的可行性,为后续研究奠定了基础。
2019年02期 v.29;No.171 122-126+198页 [查看摘要][在线阅读][下载 275K] - 郭晶;刘伟;董雪;孙博;吴丛梅;殷玉和;
[目的]利用大肠杆菌系统表达人乳头瘤病毒52型(HPV52) L1蛋白,并获得HPV52病毒样颗粒(VLPs)。[方法]优化并合成HPV52L1基因,构建p ET-30a-52L1表达载体粒,转化大肠杆菌E. coli BL21 StarTM(DE3)。经IPTG诱导表达,阳离子交换层析纯化,SDS-PAGE和Western Blotting鉴定,BALB/c小鼠免疫2次,初次后4w检测免疫血清中HPV52中和抗体滴度。[结果]获得纯度90%的HPV52L1蛋白,将获得的HPV52L1蛋白进行解组装和重组装形成VLPs,动态光散射观察到粒径约为70nm,透射电镜观察到50～60nm的均一VLPs,中和抗体滴度达25600。[结论]大肠杆菌系统表达人乳头瘤病毒52型(HPV52) L1蛋白,并经过一步柱层析纯化获得纯度达90%的L1蛋白,经解组装重组装获得粒径大小为50～60nm的VLPs,具有良好免疫原性。
2019年02期 v.29;No.171 127-132+139页 [查看摘要][在线阅读][下载 403K]
- 沙毕热木·斯热义力;张梅娟;买买提明·苏来曼;沙伟;
[目的]建立大帽藓科ISSR-PCR实验最佳反应体系。[方法]提取大帽藓科的基因组DNA,利用5因素4水平的正交设计实验方法对大帽藓科植物ISSR-PCR反应体系进行最佳反应体系的筛选。[结果]大帽藓科植物ISSRPCR的最佳反应体系为(20μL):即20μL体系中,PCR Buffer 2. 0μL、Mg2+2. 25 mmol/L,d NTP 0. 2 mmol/L,引物0.65μmol/L,Taq DNA聚合酶0. 7 U,模板DNA 10 ng。5个因素对该反应体系的影响顺序为:Mg2+>引物> d NTP> Taq DNA聚合酶>模板DNA。利用该体系,在UBC808等13种引物中进行验证,均能得到有效的扩增条带。[结论]通过对大帽藓科基因组DNA的提取及体系优化,获得了大帽藓科植物最佳反应体系,为后续应用ISSR技术鉴定大帽藓科种质资源以及遗传多样性研究奠定了基础。
2019年02期 v.29;No.171 133-139页 [查看摘要][在线阅读][下载 257K] - 王丽媛;张玉;徐明怡;伍一宁;冷海楠;许楠;倪红伟;
[目的]获得小叶章PPDK的cDNA序列,推测蛋白氨基酸理化性质及二三级结构等,以及已知物种PPDK氨基酸系统进化分析。[方法]利用RT-PCR技术扩增PPDK序列,通过ProtParam、Blast、THMHMM、SOPMA等生物信息软件分析序列。[结果]获得了小叶章PPDK的c DNA序列,长1 035 bp,相对分子量41. 910 kDa,等电点为9. 70,氨基酸中含量最高的是丝氨酸,72个;蛋白二级结构中无规卷曲占48. 83%,不含信号肽和跨膜结构,氨基酸系统进化树结果分析发现小叶章PPDK与二穗短柄草、水稻亲缘关系最近。[结论]小叶章PPDK含有385个氨基酸,含1个PDRP活性调控位点,72个参与信号传导的磷酸化位点。
2019年02期 v.29;No.171 140-146+187页 [查看摘要][在线阅读][下载 492K] - 史勇;金维环;刘姣姣;王林会;陈彦惠;
[目的]为了降低拟南芥原生质体制备的试验成本,缩短制备时间,降低转化所用质粒的浓度和提高转化效率。[方法]实验以胶带法为基础,比较多种普通胶带去除拟南芥叶片下表皮的效果,通过增加裂解叶片用量,设计不同质粒浓度梯度转化原生质体,调整转化过程中PEG处理时间和对原生质体进行暗培养。[结果]发现普通纸质和布质胶带去除拟南芥叶片下表皮效果良好。将叶片酶解时间缩短到20～30 min,转化质粒用量降低到5μg/6～10×104个原生质体;将PEG转化处理时间延长到30 min,利用暗培养降低了原生质体死亡率;用冰水混合物保存原生质体,24 h内不影响转化效率。[结论]改良后的胶带法制备原生质体成本低、用时短、转化效率高、可操作性强。
2019年02期 v.29;No.171 147-152+170页 [查看摘要][在线阅读][下载 711K] - 靳文婷;古海尼沙·买买提;艾尼瓦尔·吐米尔;
[目的]了解绿皮地卷内生真菌多样性,并初步探索抑菌活性研究。[方法]采用匀浆涂布法分离纯化,采用形态学和分子生物学方法对内生真菌进行初步的鉴定,以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为受试菌,采用菌块法检测内生真菌的抑菌活性。[结果]从绿皮地卷中共分离得到29株内生真菌,分属于6纲7目11科16属;抑菌实验结果表明:筛选得到11株内生真菌至少对一种指示菌有抑菌活性,占分离菌株总数的3. 79%。A3菌株对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别达到24. 92 mm、33. 00 mm、25. 25 mm。[结论]分离得到的29株内生真菌中青霉属(Penicillium)为优势属,其中A3菌株的抑菌效果最明显,尤其是对枯草芽孢杆菌显示较高的抑菌活性。可作为筛选抑菌活性物质的新资源。
2019年02期 v.29;No.171 153-160页 [查看摘要][在线阅读][下载 364K]
- 孙子羽;满都拉;陈忠军;吴卫辉;
[目的]研究prtR在铜绿假单胞菌抵抗外源性氧化压力时的作用。[方法]通过对双氧水处理后的生物膜残留量及其菌株存活率的定量来研究铜绿假单胞菌中prtR对双氧水抗性的影响;通过RT-PCR的方法研究在双氧水处理后,绿脓杆菌素在含有空载体或过表达prtR载体的PAK中mRNA水平与抗双氧水能力变化的关系。[结果]过表达prtR能显著提高双氧水处理时,铜绿假单胞菌生物膜状态下的存活率;存活率的提高是由绿脓杆菌素的表达被抑制实现的,而由prtR调控的一定水平的绿脓杆菌素表达对铜绿假单胞菌抗双氧水是必要的。[结论]prtR能够通过影响绿脓杆菌素的表达,提高铜绿假单胞菌抵抗外源性氧化压力的能力。
2019年02期 v.29;No.171 161-164+192页 [查看摘要][在线阅读][下载 175K] - 赵云娟;张峰波;马嘉嘉;徐茜;张春桃;郭南;张佳;丁剑冰;
[目的]分析sTim-3与CD4~+ T细胞亚群细胞因子在维吾尔族肺结核患者中的表达及相关性。[方法]收集肺结核患者45例和健康对照40例外周血,ELISA方法检测研究对象血清中sTim-3、IFN-γ、IL-4、IL-17A和IL-22的含量,Pearson法分析肺结核患者血清中sTim-3与上述细胞因子间的相关性。[结果]肺结核患者、痰涂片阳性和阴性组血清sTim-3、IL-4、IL-17A和IL-22含量均高于对照组,IFN-γ含量均低于对照组(P <0. 05); sTim-3与IFN-γ负相关(r=-0. 473,P=0. 001),与IL-4正相关(r=0. 326,P=0. 029),与IL-17A、IL-22间均无相关性(P> 0. 05)。[结论]肺结核患者体内sTim-3、IL-4、IL-17A和IL-22高表达,IFN-γ低表达,sTim-3与IFN-γ、IL-4具有相关性,sTim-3可能通过影响CD4~+ T细胞亚群细胞因子的分泌参与维吾尔族肺结核的发病。
2019年02期 v.29;No.171 165-170页 [查看摘要][在线阅读][下载 169K] - 吴仙华;陈伟;尚丹;林嘉杰;许馨;李芳芳;孙绍光;
[目的]构建lncRNA FQ223609真核表达载体,并且探讨其促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖的调控机制。[方法]通过RT-PCR扩增得到735 bp的lncRNA FQ223609基因序列,以质粒p CMV-CHA为骨架构建FQ223609真核表达载体,通过HindⅢ/XhoⅠ酶切及测序进行鉴定;将FQ223609真核表达载体及其对照空载体p CMV-C-HA分别转染VSMCs,CCK-8分析细胞活力,Western Blot检测脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达水平。[结果]双酶切及测序鉴定显示插入lncRNA FQ223609 c DNA序列正确; CCK-8结果表明过表达lncRNA FQ223609使VSMCs增殖活力提高22%; Western Blot结果表明LPL和PCNA的表达水平显著上调。[结论]lncRNA FQ223609真核表达载体成功构建; lncRNA FQ223609通过上调LPL的表达,促进VSMCs增殖。
2019年02期 v.29;No.171 171-176+182页 [查看摘要][在线阅读][下载 299K] - 屈品均;杜庆;姚奥;项园;黄凤;张慧敏;戴周彤;张子健;李慧;廖兴华;
[目的]探讨ERα-36和STAT3通过MMP2和MMP9对乳腺癌细胞迁移的影响。[方法]使用Transwell实验检测ERα-36和STAT3对乳腺癌细胞迁移能力的影响,荧光定量PCR和Western Blot检测在乳腺癌细胞中过表达ERα-36和STAT3对MMP2和MMP9表达的影响,Luciferase实验检测ERα-36和STAT3对MMP2和MMP9启动子转录活性的影响。[结果]与对照组相比,过表达STAT3组的乳腺癌细胞迁移能力明显升高(P <0. 05),两种与迁移相关蛋白MMP2和MMP9表达量均升高(P <0. 05);过表达STAT3增强了乳腺癌细胞中MMP2和MMP9的转录活性,而ERα-36过表达对MMP2和MMP9的转录活性具有较弱的影响。但是共表达ERα-36和STAT3显著增强了MMP2和MMP9的转录活性与表达。[结论]ERα-36和STAT3协同结合到MMP2和MMP9的启动子上,促进它们的转录与表达进而促进乳腺癌细胞迁移。
2019年02期 v.29;No.171 177-182页 [查看摘要][在线阅读][下载 292K] - 彭延杰;丁艳;曹强庚;
[目的]验证及提高乳腺癌靶向药物TP25粗制品活性,判断TP25杀伤癌细胞方式。[方法]配置含有精氨酸及还原型谷胱甘肽的复性液,并设置复性液p H为8. 5与9. 5,分别利用透析法与稀释法进行复性; MTT法验证TP25对乳腺癌细胞(SK-BR-3)的靶向性识别与杀伤作用;使用Casepase-1抑制剂z-YVAD-CHO确定TP25导致SKBR-3死亡的方式。[结果]优化制备工艺后粗制品的IC50(50%抑制浓度)由0. 051 0μg/m L提高至0. 029 9μg/m L;z-YVAD-CHO抑制实验中,4、19、22、25、28 h结果 P值均小于0. 01。[结论] TP25对乳腺癌细胞(SK-BR-3)杀伤作用具有明显的靶向性;采用稀释复性工艺后TP25粗制品的比活比初始值提高了41%; TP25可引起SK-BR-3发生细胞焦亡(Pyroptosis)。
2019年02期 v.29;No.171 183-187页 [查看摘要][在线阅读][下载 196K] - 周林;赵林;李昆仑;岳秋林;
[目的]利用生物转化法制备海藻多糖,并筛选得到生物转化海藻多糖抗氧化能力最佳的菌株。[方法]采用复合酶解和微生物转化的方法,以ABTS自由基清除率检测为评价指标,对不同菌株生物转化后的海藻多糖进行比较,结合高效液相色谱仪(HPLC)检测微生物转化前后海藻多糖的变化。[结果]复合酶解后的水溶性海藻提取物经单一真菌菌株、单一细菌菌株、混合菌株发酵后,检测对ABTS自由基清除率,结果表明,经植物乳杆菌酵母菌混合菌株发酵后,对ABTS自由基的清除率最高,高达87. 5%。[结论]植物乳杆菌、酵母菌复合菌株转化后的海藻多糖对ABTS自由基清除率最高,与转化前海藻多糖相比清除率提高51. 2%,HPLC检测发现,其海藻多糖的成分增加,其保留时间为6. 186、8. 014、9. 365 min。
2019年02期 v.29;No.171 188-192页 [查看摘要][在线阅读][下载 245K] - 曹焜;孙宇峰;王晓楠;韩承伟;潘冬梅;姜颖;赵越;张晓艳;郭永霞;
[目的]明确工业大麻对根际土壤酶活性的影响规律。[方法]田间种植火麻一号、格里昂、金刀-15和格列西亚,在不同生长阶段采集根际土,分析不同品种工业大麻对土壤酶活性影响。[结果]土壤过氧化氢酶活性总体呈上升趋势,峰值为0. 89 m L·g~(-1)·20min~(-1);蔗糖酶、脲酶和磷酸酶的峰值(分别为14. 76 mg·g~(-1)·d~(-1)、338. 64和79. 57μg·g~(-1)·h~(-1))出现在快速生长期,随后呈下降趋势。工艺成熟期,火麻一号和格列西亚的蔗糖酶活性(分别为10. 07、11. 03 mg·g~(-1)·d~(-1))高于其它品种;火麻一号的脲酶活性(161. 34μg·g~(-1)·h~(-1))高于其他三个品种;格列西亚的磷酸酶活性(29. 98μg·g~(-1)·h~(-1))高于其他三个品种。[结论]随着工业大麻生长,土壤过氧化氢酶活性总体呈上升趋势;土壤蔗糖酶活性呈波动性变化,在快速生长期达峰值;土壤脲酶和磷酸酶活性呈先升高后降低的趋势,在快速生长期达峰值。工业大麻通过提高过氧化氢酶和蔗糖酶活性促进土壤养分转化,能增强土壤有机碳转化。
2019年02期 v.29;No.171 193-198页 [查看摘要][在线阅读][下载 178K]