- 王晶;樊振川;
[目的]制备莱茵衣藻小G蛋白BBS3b的多克隆抗体。[方法]利用莱茵衣藻bbs3b基因的c DNA序列分别构建了带有GST和6×His标签的原核表达载体p GEX-2T-BBS3b和p ET-28a(+)-BBS3b并转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,以12%SDS-PAGE鉴定。用纯化的GST-BBS3b融合蛋白免疫新西兰大白兔,采集第4次免疫后血液并分离血清,利用间接ELISA法进行效价测定,并将抗血清依次经过Protein A纯化和硝酸纤维素膜纯化,用Western Blotting检测抗体特异性。[结果]GST-BBS3b和6×His-BBS3b融合蛋白的分子量分别为46、20 k Da。用ELISA的方法测定抗血清效价为512 000,Western Blotting检测结果显示制备的多克隆抗体能够特异性识别莱茵衣藻BBS3b蛋白。[结论]制备的多克隆抗体效价为512 000,能够特异性识别莱茵衣藻中BBS3b蛋白,为利用莱茵衣藻作为模式生物进行BBS3b在纤毛信号传导中的作用机理研究奠定了基础。
2017年04期 29+64-69页 [查看摘要][在线阅读][下载 2349K] - 席欧彦;贾二坷;赵婷;秦瑞坪;马晓玲;李江伟;
[目的]研究旨在制备抗CD47小分子单链抗体,并分析其与抗原的结合能力和阻断作用的活性。[方法]采用DNA合成方法,将抗CD47的单克隆抗体B6H12的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),通过短肽(Gly4Ser)3连接形成B6H12单链抗体(B6H12-scFv),在大肠杆菌中可溶性表达并纯化B6H12-scFv。ELISA和Western Blot方法检测与人重组CD47的结合。检测EC9706和KYSE150两种食管癌细胞表面CD47的表达,细胞ELISA和流式细胞术分析B6H12-scFv与细胞表面CD47的结合。最后采用竞争ELISA分析B6H12-scFv对CD47与髓样细胞表面的信号调节蛋白α(SIRPα)结合的阻断能力。[结果]成功获得纯度达到90%以上的可溶性单链抗体。EC9706和KYSE150细胞均高表达CD47。细胞ELISA和流式检测B6H12-scFv浓度为50μg/m L可与EC9706表面CD47有较好结合。B6H12-scFv浓度为40μg/m L时也可以竞争性阻断CD47与SIRPα的结合。[结论]成功地构建了抗CD47单链抗体,浓度在20μg/m L具有EC9706的结合活性,也具有阻断作用。
2017年04期 70-77页 [查看摘要][在线阅读][下载 2844K] - 张远利;王红勋;李春梅;张玥;兰燕宇;孙祥明;
[目的]制备鼠抗人PCNA Mab与人IgG的交联物作为临床分析阳性参考品。[方法]利用杂交瘤技术制备鼠抗人PCNA Mab,在SPDP的作用下与人IgG交联,建立ELISA方法评估其作为参考品的可行性。[结果]获得2株鼠抗人PCNA杂交瘤细胞;免疫印迹表明鼠抗人PCNA Mab与人IgG交联后对人PCNA和抗人IgG抗体均具有反应性;以该交联物作为参考品建立的ELISA中,300μg/L~4.69μg/L范围内,R2达0.994、准确度为88.26%~99.66%、相对标准偏差4.66%~17.95%;稀释400倍后,血清基质对检测结果没有明显干扰;SLE病人样本(n=41)的ELISA均值和高值均大于健康人(n=22);临床免疫膜条确认的阴阳性样本的ELISA结果分别16.44±1.30μg/m L和6.05±0.50μg/m L,与判别结果相关。[结论]鼠抗人PCNA Mab-人IgG交联物可作为阳性参考品应用于PCNA自抗体的免疫分析。
2017年04期 v.27;No.161 378-382页 [查看摘要][在线阅读][下载 2662K] - 沈天成;白亚军;郑晓辉;蔡宇杰;
[目的]对奇异变形杆菌JN458 D-乳酸氧化酶进行酶学性质研究。[方法]克隆D-乳酸氧化酶基因(lod D),构建重组质粒在大肠中表达,生物信息学初步分析D-乳酸氧化酶氨基酸序列,镍柱纯化该酶并研究其性质。[结果]生物信息学分析该酶C-末端含膜结合结构域,所以是膜蛋白,属于以醌作为电子受体的D-乳酸氧化酶。最适温度60℃,50℃下保持稳定1 h,中高温适应性较好。最适pH 7,pH 7~9下保持稳定1 h。以D-乳酸为底物时Km值为0.61 mmol/L,对D-乳酸有很高的亲和力。Fe~(2+)、Mn~(2+)和Mg~(2+)在1~6 mmol/L的浓度内能提高酶活,其中Fe~(2+)效果最好。[结论]lod D在大肠中实现了高效表达,使新型D-乳酸氧化酶的应用有了理论依据。
2017年04期 v.27;No.161 383-389页 [查看摘要][在线阅读][下载 2622K]
- 刘超波;孙俊;潘秀和;蒋雯雯;李燕;李明才;
[目的]构建小鼠白介素(interleukin,IL)-39单链融合基因及其真核表达载体。[方法]通过RT-PCR得到小鼠EB病毒诱导基因3(Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3)及IL-23p19基因的全长编码区。通过重叠延伸PCR和编码疏水性多肽接头(linker)(Gly4Ser)3的DNA序列将小鼠EBI3全长编码区及IL-23p19成熟肽编码区连接起来,构建小鼠IL-39单链融合基因,并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1/V5-His中,通过限制性内切酶双酶切及基因测序鉴定阳性重组载体。[结果]通过重叠延伸PCR得到1 254 bp大小的目的条带,测序分析显示,小鼠IL-39单链融合基因中EBI3、linker和IL-23p19的基因序列及连接顺序和方向均完全正确。[结论]成功构建了小鼠IL-39单链融合基因及其真核表达载体。
2017年04期 v.27;No.161 307-311页 [查看摘要][在线阅读][下载 718K] - 李淑艳;蒋润枝;
[目的]寻求解决莲藕栽培种普遍对盐敏感的途径,从耐盐野生种中克隆了一个候选耐盐基因-LrNHX的全长c DNA序列,并对其表达进行分析,为今后利用基因工程技术改良莲藕耐盐性奠定基础。[方法]根据NCBI数据库中的莲藕Na~+/H~+逆向转运蛋白基因序列设计引物,利用PCR技术在莲藕叶片中克隆LrNHX,再利用半定量RT-PCR研究了250 mmol/L Na Cl处理0 h、6h、12 h、18 h、24 h和30 h时莲藕叶片中LrNHX的表达情况。[结果]LrNHX cDNA全长1 861 bp,编码526个氨基酸。Blast比对后发现该基因和与胡杨(ACX46912.1)、毛白杨(AAX37333.1、番茄(CAC83608.1)、拟南芥(NP 178079.2)的同源性分别达88%、87%、83%、82%。半定量RT-PCR结果表明,该基因在250 mmol/L Na Cl处理12 h后表达显著增高,说明LrNHX受盐诱导。[结论]LrNHX参与了莲藕耐盐信号的转导。
2017年04期 v.27;No.161 312-316页 [查看摘要][在线阅读][下载 8254K] - 李娟;汪志星;曲延英;陈全家;邓莉;郑凯;刘娜;黄启秀;高文伟;张霞;
[目的]WOX9基因在植物的胚胎发育过程中发挥一定作用。[方法]根据已公布的雷蒙德氏棉WOX9基因序列的CDS设计一对引物,从海岛棉‘新海16’中克隆一个同源基因GbWOX9。通过实时荧光定量分析其在棉花体细胞胚不同阶段的表达模式。[结果]获得了1 038 bp的GbWOX9基因的开放阅读框(ORF),编码345个氨基酸,预测蛋白分子量约为38 264.54 k Da,等电点为6.7。通过结构域分析,发现GbWOX9中含有一个由65个氨基酸组成的保守同源异型结构域。系统进化树分析结果表明GbWOX9与亚洲棉Ga WOX9亲缘关系较近。亚细胞定位预测该基因可能定位于细胞核。qRT-PCR表明,GbWOX9基因的表达量在‘新海16’胚胎发育阶段的球形胚>鱼雷胚>心形胚>胚性愈伤。[结论]根据相对表达量数值估算,GbWOX9在球形胚的表达量是鱼雷胚的1.3倍,是心形胚的3.1倍,是胚性愈伤的5.2倍。故该基因在‘新海16’体细胞胚阶段的球形胚中表达量最高。
2017年04期 v.27;No.161 317-323+311页 [查看摘要][在线阅读][下载 7231K] - 尹艳;张宏晨;徐妍妍;高伟;张夏楠;
[目的]构建丹参SmIPI1和SmIPI2基因的RNA干扰植株体系。[方法]利用Gateway技术分别构建SmIPI1和SmIPI2的干扰表达载体p K7GWIWG2D(Ⅱ),并借助根癌农杆菌EHA105菌株介导遗传转化,并通过抗性标记筛选、Egfp荧光和qRT-PCR检测阳性植株和转化效果。[结果]表达克隆构建后转化大肠杆菌菌液PCR检测显示阳性,遗传转化外植体并经抗性培养基继代筛选获得的转化植株根尖在荧光显微镜下呈强烈绿色荧光,且SmIPI1和SmIPI2基因的相对表达量下调幅度分别在64%~82%和23%~78%之间。[结论]成功构建丹参SmIPI1和SmIPI2基因的RNA干扰表达载体并转化丹参植株,为探索SmIPI基因家族成员各自功能问题提供了研究材料基础。
2017年04期 v.27;No.161 324-329页 [查看摘要][在线阅读][下载 2342K] - 秦慧彬;李梦菲;杨洪江;
[目的]对黑曲霉纤维二糖水解酶cbhA基因进行了克隆和在毕赤酵母中的真核表达。[方法]采用PCR方法扩增黑曲霉纤维二糖水解酶A(Cellobiohydrolase A,CBHA)基因,获得的DNA序列与cbhA基因表现出高度相似,推导出的氨基酸序列与真菌CBHA酶也高度相似,属于糖基水解酶第7家族。将扩增得到的cbhA基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,与α-因子信号肽序列形成融合蛋白,进一步通过电转化方法将线性化质粒p PIC9K-cbhA转化至毕赤酵母GS115菌株进行表达。[结果]在甲醇诱导下,重组菌株CMC比酶活力是对照的2.5倍,SDS-PAGE分析结果也确认了cbhA基因在重组菌株GS115/p PIC9K-cbhA中的表达。对该酶性质的分析表明,重组CBHA酶水解CMC底物最适p H值为5.0,最适温度为55℃。[结论]黑曲霉纤维二糖水解酶基因cbhA的克隆和其真核表达工程菌株的构建,为获得纤维二糖水解酶A高产菌株,实现纤维素酶多组分的人工组装奠定了基础。
2017年04期 v.27;No.161 330-336页 [查看摘要][在线阅读][下载 1928K] - 张树军;狄建军;
[目的]构建大肠杆菌功能未知基因ybf E的pET16b、pET32a和p GEX-4T-1三种原核表达系统,通过对比表达水平筛选出最优表达体系,并纯化表达的可溶性Ybf E融合蛋白。[方法]使用pET16b、pET32a和p GEX-4T-1表达质粒构建pET16b-ybf E、pET32a-ybf E和p GEX-4T-1-ybf E原核表达载体,分别转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达Ybf E融合蛋白,对三种表达系统的表达水平进行对比,并对pET16b-ybf E和pGEX-4T-1-ybf E表达体系的裂菌上清中的可溶性Ybf E融合蛋白液分别使用镍柱和GST蛋白纯化柱纯化。[结果]构建了pET16b-ybf E、pET32a-ybf E和p GEX-4T-1-ybf E原核表达体系,并使用IPTG诱导表达Ybf E融合蛋白。ybf E在p GEX-4T-1载体内的表达水平最高,接下来依次为pET16b和pET32a。pET16b-ybf E和p GEX-4T-1-ybf E表达的可溶性Ybf E融合蛋白纯化后浓度分别为86μg/m L和724μg/m L。[结论]成功构建了ybf E基因的三种原核表达系统,筛选出最佳表达体系,可溶性Ybf E融合蛋白得到纯化。
2017年04期 v.27;No.161 337-341+382页 [查看摘要][在线阅读][下载 1363K]
- 杨友辉;杨健;宋菲;薛维娜;孙佳;王爱民;兰燕宇;刘亭;
[目的]以合成抗原EGFRvⅢ-BSA作为被检测物,建立检测抗EGFRvⅢ单链抗体的间接ELISA检测方法并优化其反应条件。[方法]利用N-马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)将EGFRvⅢ与BSA偶联制备抗原。利用方阵滴定法对间接ELISA法的抗原包被浓度,单链抗体的稀释度、包被时间和温度、包被液、抗His-tag多抗稀释度和酶标抗体的稀释度进行优化,并对建立的间接ELISA方法的方法学进行验证。[结果]通过SDS-PAGE电泳和全波长紫外扫面显示EGFRvⅢ-BSA合成成功。用PBS于37℃包被1.25μg/m L的EGFRvⅢ-BSA 2 h,加入19.044μg/L的ChiMR1、1∶8 000的兔抗His-tag多抗和1∶10 000酶标抗体可获得最佳ELISA检测结果。应用优化后的条件检测4.761~152.35μg/L范围内的ChiMR1显示线性良好。线性方程为y=(A-D)/[1+(x/C)^B]+D(A:1.99706;B:-1.09760;C:35.54885;D:0.01558),R2=0.99923;60μg/L和20μg/L的质控品的检测精密度分别为7.142%和4.828%;准确度分别为91.8%和82.90%,准确度和精密度良好。[结论]建立的间接ELISA方法的线性、准确度和精密度良好,为临床疾病的检测奠定良好基础。
2017年04期 v.27;No.161 342-348页 [查看摘要][在线阅读][下载 1697K] - 王娟;赵晓辉;罗海华;姜勇;
[目的]探讨内毒素血症Rig-Ⅰ表达调控的机制。[方法](1)DNA-pull down、2D-DIGE结合生物质谱技术筛选分离、鉴定对照和内毒素血症小鼠肝组织核蛋白与Rig-Ⅰ基因启动子结合的差异蛋白质;(2)q PCR和细胞免疫荧光检测LPS刺激RAW264.7细胞hnRNP A3 mRNA表达及细胞内定位。[结果](1)筛选鉴定得到hnRNP A3等7种与内毒素血症Rig-Ⅰ基因启动子结合的蛋白质;(2)LPS刺激下hnRNP A3 mRNA显著升高(P<0.01),且具有明显的细胞核定位。[结论]共有7种蛋白质参与内毒素血症Rig-Ⅰ基因表达调控,为进一步Rig-Ⅰ表达调控的研究奠定了良好基础。
2017年04期 v.27;No.161 349-354+377页 [查看摘要][在线阅读][下载 2220K] - 杨毅;王兆松;牛瑞芳;
[目的]分析肺鳞癌中Hsa-miR-98的靶基因及参与的生物学过程和信号通路。[方法]分析TCGA中收录的肺鳞癌患者的Hsa-miR-98及生存数据,通过4个靶基因数据库和表达数据分析Hsa-miR-98靶基因,利用Bi NGO富集分析靶基因功能,通过DAVID数据库富集分析靶基因信号通路。[结果]高表达Hsa-miR-98延长肺鳞癌患者总生存率和无复发生存率。综合4个数据库分析结果,得到Hsa-miR-98的113个靶基因,其中82个在肺鳞癌患者癌与癌旁差异表达。GO分析表明4个基因参与细胞胶原的组成,59个基因参与细胞的生命活动,KEGG通路富集到7条通路,包括肿瘤发生发展、阿米巴运动、胞外基质的形成等。[结论]82个Hsa-miR-98靶基因通过7条信号通路,影响细胞生命活动,进而调控肿瘤发生发展,使高表达Hsa-miR-98患者生存期延长。
2017年04期 v.27;No.161 355-363页 [查看摘要][在线阅读][下载 1527K]
- 刘春燕;高建峰;桑明;周立;杨四军;
钙调磷酸酶调节因子1基因是新兴发现的致病基因,该文综述近几年该基因与疾病研究的最新进展,为相关疾病的治疗提供思路。该文依次介绍钙调磷酸酶调节因子1基因及其表达方式,该基因参与三种疾病的方式的异同,并罗列了目前研究中遇到的问题,提出有效的措施,最后对该基因在疾病治疗中的应用进行展望。钙调磷酸酶调节因子1基因作为一个致病基因,其涉及疾病广泛多样,深入了解其作用机制,对疾病的治疗将大有好处。
2017年04期 v.27;No.161 390-395+408页 [查看摘要][在线阅读][下载 1051K] - 郝建安;张晓青;杨波;司晓光;姜天翔;杜瑾;张爱君;任华峰;王静;
表面活性剂是一种重要的工业原料,微生物表面活性剂是表面活性剂的一种,由于其来源于微生物,具有高效且低毒的特点,是一种环境友好型的表面活性剂,逐渐成为近年来表面活性剂研究的热点,并已在多个领域进行了应用尝试。该文从不同类型的微生物表面活性剂入手,阐述近几年来不同类型的微生物表面活性剂在不同领域的应用,比较了不同种类微生物表面活性剂的应用现状,同时对微生物表面活性剂应用存在的问题进行了分析,并对微生物表面活性剂未来的发展趋势进行了展望。
2017年04期 v.27;No.161 396-402页 [查看摘要][在线阅读][下载 168K] - 李军;甄世军;张翠云;张胜;宁卓;
为了较系统地了解基因芯片在地下水污染研究中的应用进展,调研了基因芯片技术及其在地下水污染研究中应用的有关文献,简述了基因芯片原理、分类及实施流程,总结了系统发育寡核苷酸芯片和功能基因芯片在地下水污染研究中的最新应用进展,探讨了基因芯片检测性能、数据分析和应用等方面存在的问题和措施,在基因芯片性能改进和应用方面提出了进一步研究的方向。
2017年04期 v.27;No.161 403-408页 [查看摘要][在线阅读][下载 154K] 下载本期数据