- 赵小峰;金磊;汪瑶;吴桂梅;贺玲;
[目的]构建人ASK1基因原核表达载体并进行生物信息学分析。[方法]以pCDNA3.1-hASK1为模板扩增hASK1基因,构建pGEX-KG-hASK1重组质粒,菌落PCR筛选阳性克隆并进行测序验证,最后对hASK1蛋白进行生物信息学分析。[结果]成功构建原核表达载体pGEX-KG-hASK1。生物信息学分析显示,hASK1蛋白由1 374个氨基酸残基组成,等电点5.52,相对分子质量154.5 k Da。该蛋白无跨膜区结构,二级结构由α-螺旋、折叠延伸链、无规卷曲构成。[结论]hASK1蛋白是含1 374个氨基酸残基的亲水蛋白,含79个磷酸化位点,能与多种信号蛋白相互作用。
2016年06期 v.26;No.157 511-515页 [查看摘要][在线阅读][下载 758K] - 唐双阳;刘志敏;李冉辉;申海艳;赵兰华;蔡恒玲;万艳平;
[目的]构建大鼠ATRX抗原端氨基酸序列的原核表达载体,为进一步制备ATRX多克隆抗体以及探讨ATRX蛋白在HPV16致宫颈癌中的作用奠定基础。[方法]以IF-GFP-ATRX质粒为模板,PCR扩增获得ATRX-C_(2193-2492)基因片段,并克隆至p ET30a(+)空载体上,转化E.coli BL21感受态细胞,构建原核表达载体p ET30a/ATRX-C_(2193-2492),经PCR、双酶切以及测序鉴定。将构建好的质粒p ET30a/ATRX-C_(2193-2492)转化,经IPTG诱导表达,利用镍离子亲和层析法纯化6His-ATRX-C_(2193-2492)蛋白。[结果]成功获得900 bp的ATRX-C_(2193-2492)基因片段并构建了原核表达载体p ET30a/ATRX-C_(2193-2492),且该载体能在E.coli中诱导表达分子量约34 k Da蛋白产物。[结论]原核表达载体p ET30a/ATRX-C_(2193-2492)能成功诱导表达分子量约34 k Da的ATRX-C_(2193-2492)蛋白,该蛋白纯化产物能为后续ATRX多克隆抗体的制备提供实验基础。
2016年06期 v.26;No.157 516-520页 [查看摘要][在线阅读][下载 571K] - 杨仕坤;曾子悦;朱亚利;李论;吕亚丰;王艳林;
[目的]原核表达和纯化人多胺调节因子-1(PMF-1)并以此为抗原制备多克隆抗体。[方法]PCR扩增人PMF-1编码序列并构建原核表达质粒。将此质粒转化大肠杆菌后,IPTG诱导PMF-1蛋白表达并在变性条件下用NiNTA树脂纯化。将纯化的PMF-1用作抗原免疫大耳白兔以制备抗PMF-1多克隆抗体。ELISA法检测抗体效价,免疫印迹法和细胞免疫化学法分析抗体特异性。[结果]成功构建PMF-1原核表达质粒,在大肠杆菌中IPTG可诱导该质粒高效表达PMF-1蛋白。以纯化的PMF-1蛋白为抗原免疫大耳白兔后,获得高效价的抗PMF-1抗血清(抗体效价为1∶128 000)。该抗体能与PMF-1蛋白特异性结合,并可用于PMF-1的免疫印迹和细胞免疫化学分析。[结论]成功建立了人PMF-1原核表达和纯化技术,并制备出高特异性的抗PMF-1多克隆抗体,该抗体可用于PMF-1的免疫印迹分析和细胞免疫化学分析。
2016年06期 v.26;No.157 521-525页 [查看摘要][在线阅读][下载 601K] - 张红梅;尤晓颜;龚明贵;李婷婷;王媛媛;
[目的]构建枯草芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)原核载体,表达、纯化TrxR重组蛋白,制备并鉴定多克隆抗体。[方法]通过分子克隆获得TrxR蛋白的表达菌株;利用镍离子亲和层析获得纯化的TrxR重组蛋白,免疫兔子制备TrxR蛋白多克隆抗体;采用ELISA法测定抗体效价;Western Blot检测抗血清的特异性。[结果]TrxR重组载体双酶切结果与DNA测序鉴定结果一致,蛋白表达纯化条带大小与预测一致。ELISA法测定抗血清效价为7×104,Western Blot证实抗血清有较高的特异性。[结论]成功克隆、表达与纯化TrxR重组蛋白,制备并鉴定兔子多克隆抗体,为TrxR的生物学功能研究奠定基础。
2016年06期 v.26;No.157 526-531页 [查看摘要][在线阅读][下载 1012K] - 董彬;吴松;王晶;孟德梅;樊振川;
[目的]制备莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT27的多克隆抗体。[方法]利用莱茵衣藻ift27基因的cDNA序列构建了原核表达载体p ET28a-ift27和p MAL-C2X-ift27,转入大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,获得了6×His/MBPIFT27两种重组融合蛋白。将纯化后的MBP-IFT27融合蛋白免疫新西兰大白兔,5次后采集抗血清,间接ELISA法测定效价,并对抗血清依次经protein A和抗原抗体两步纯化后使用Western Blot和免疫荧光对抗体特异性进行检测。[结果]MBP/6×His-IFT27融合蛋白表达后分子量分别为27 k Da和67 k Da。ELISA测定其效价为1∶256 000,Western Blot检测可特异性识别莱茵衣藻中的IFT27蛋白,免疫荧光结果显示可检测到纤毛中的IFT27蛋白。[结论]制备出特异性抗莱茵衣藻IFT27的多克隆抗体,效价为1∶256 000,Western Blot可特异性检测到莱茵衣藻中IFT27蛋白的目的条带,免疫荧光可定位IFT27在细胞内分布。
2016年06期 v.26;No.157 532-538页 [查看摘要][在线阅读][下载 1613K] - 孙霞;刘建;刘艳玲;
[目的]旨在探求自诱导系统在精氨酸脱羧酶表达活性及催化活性方面的可行性。[方法]采用PCR方法,从Escherichia coli BL21基因组中扩增出精氨酸脱羧酶基因spe A,构建重组菌E.coli BL21-p ET20b(+)-spe A。分别用ZYM-5052自诱导培养基和LB-IPTG诱导培养基对重组菌株进行诱导,用HPLC法测定酶活性和转化产物含量。[结果]精氨酸脱羧酶基因在大肠杆菌中得到有效表达,其相对分子量为70 k Da。采用自诱导途径表达精氨酸脱羧酶,与IPTG诱导相比,自诱导菌体OD600是其1.95倍,酶活性是其6倍。自诱导比IPTG诱导菌体转化生成胍基丁胺的含量高1.8 g/L,转化率提高12.5%。[结论]精氨酸脱羧酶基因spe A可通过自诱导获得大量表达,且表达活性及催化活性比传统IPTG诱导效果更好,该研究为重组酶的高水平表达提供了有效的方法。
2016年06期 v.26;No.157 539-545页 [查看摘要][在线阅读][下载 866K]
- 胡焱;段志强;嵇辛勤;阮涌;赵佳福;雷云;万彪;
[目的]对鸡importin β1基因进行克隆和生物信息学分析。[方法]根据Gen Bank公布的鸡importin β1基因序列(XM_015299473)设计合成特异性引物,通过RT-PCR从DF-1细胞中扩增importin β1基因CDS区并进行克隆和测序,利用生物信息学工具对其理化性质、二级结构和系统进化树进行分析。[结果]鸡importin β1基因CDS全长2 268bp,共编码755个氨基酸,该蛋白等电点为4.61,相对分子质量84.15 k Da,分子式为C3712H5901N979O1152S46。蛋白质二级结构预测显示,鸡importin β1蛋白含有丰富的二级结构,以α-螺旋为主(占64.90%)。importin β1基因同源性及系统进化树分析结果表明鸡与鹌鹑的亲缘关系最近。[结论]鸡importin β1基因的克隆和生物信息学分析为进一步研究其功能奠定了基础。
2016年06期 v.26;No.157 546-550+556页 [查看摘要][在线阅读][下载 2518K] - 童志霞;李天森;张辉;陈创夫;
[目的]获得高效表达并且抗原性较好的VirB5蛋白,并分析其生物信息学功能。[方法]以羊种布鲁氏菌16M基因组为模板扩增VirB5基因,连接表达载体p ET-32a,并转化至大肠杆菌(DE3)中表达,用SDS-PAGE和Western Blot检测其免疫学特性,采用信息生物学方法对VirB5基因编码蛋白的理化性质、结构、保守结构域进行分析。[结果]成功克隆出VirB5基因,并在大肠杆菌中成功表达,SDS-PAGE和Western Blot证实表达重组蛋白对布鲁氏菌阳性血清具有反应原性,生物信息学方法推测VirB5基因可能在胞内运输功能方面发挥重要作用。[结论]成功克隆出717bp大小的VirB5基因,并在大肠杆菌中成功表达45 k Da大小的蛋白,具有良好的抗原性,且证明VirB5蛋白与布鲁氏菌的胞内运输相关。
2016年06期 v.26;No.157 551-556页 [查看摘要][在线阅读][下载 1140K] - 马素珍;石宁;刘丹丹;冯黎;杨少文;朱艳琴;
[目的]利用生物信息学方法预测分析人CREB1基因的启动子情况及蛋白质的理化性质、亲疏水性、细胞亚定位、蛋白质多级结构、与之相互作用的蛋白质以及GO注释。[方法]利用相应软件及网站预测分析CREB1基因及其蛋白的相关信息。[结果]发现CREB1基因存在4个启动子,其转录受SP1和AP-2影响较大;其蛋白质是由431个氨基酸组成的主要定位于细胞核的不稳定亲水蛋白,其等电点为5.44,序列在多个物种间保守性强;二级结构主要由α螺旋和无规卷曲;需要更多可靠的模板构建三级结构;CREB1调控由c AMP介导的信号通路,对神经系统疾病及肿瘤的发生发展有重要作用。[结论]SP1和AP2通过调控多个启动子影响CREB1的表达,其蛋白质主要定位于细胞核,通过调控c AMP介导的信号通路维持人体正常生理状态。
2016年06期 v.26;No.157 557-565+573页 [查看摘要][在线阅读][下载 1803K] - 王媛;韩如意;苏玉贞;孙丽;张连民;王晨;
[目的]预测人CITED4基因启动子信息及其蛋白质的理化性质、亲疏水性、细胞亚定位、蛋白质结构、相互作用蛋白质以及GO注释,以期为发现其新功能提供理论和结构基础。[方法]利用Promoter Scan、Prot Param和Clustal X2.1等预测分析CITED4基因及其蛋白的相关信息。[结果]CITED4基因有2个启动子,其转录活性受SP1、AP-2和CREB影响;其蛋白质是由184个氨基酸组成的主要定位于细胞核的不稳定疏水蛋白质,不稳定系数为65.05;氨基酸序列在152~173间保守性强;二级结构含有47个α螺旋16个β折叠;三级结构的建立需要更多可靠的模板,CITED4通过与AP-2等转录因子相互作用调控多个基因的转录活性。[结论]CITED4表达受SP1、AP-2和CREB的调控,CITED4蛋白通过调节多个靶基因的转录调控人体正常生理或病理状态。
2016年06期 v.26;No.157 566-573页 [查看摘要][在线阅读][下载 1335K] - 郑永富;王姗姗;高庆华;钱梦阳;宫昌海;陈晓利;韩春梅;
[目的]新疆罗布羊群体遗传变异与起源分化的研究,可为罗布羊品种形成、保护和种质特性研究利用提供理论基础。[方法]利用7个微卫星(SSR)位点及mt DNA D-loop环序列分析了新疆尉犁地区120头罗布羊群体遗传多样性,及与其它新疆南部地方羊种与中国绵羊的三大母系:藏羊、蒙古羊和哈萨克羊,三个野羊种:羱羊、摩佛伦羊、盘羊和亚洲型A型、欧洲型B型的母系遗传距离与进化关系。[结果]罗布羊群体平均等位基因数(K)、观察杂合度(HO)、期望杂合度(HE)、多态信息含量(PIC)分别为8.86、0.711、0.791和0.769;发现BM143位点存在罗布羊群体HW不平衡现象。罗布羊分成A系、B系和C系3个进化系,B系进化支与欧洲B型和多浪羊遗传距离较近,聚为一类;C系进化支先与巴音布鲁克羊聚为一支,然后和A进化支聚成一类,再与新疆其它地方羊种及蒙古羊、藏羊、亚洲型A型聚为一类。三个支系中B支系与摩佛伦羊(O.musmon)的关系较近。[结论]新疆尉犁地区罗布羊群体遗传多样性丰富,具有较高育种价值;群体微卫星BM143位点存在的HW不平衡现象;罗布羊有3个进化系,聚类分析结果初步认为罗布羊是由中东经蒙古高原到达新疆,后来与新疆南部地方羊种混杂的品种。
2016年06期 v.26;No.157 574-580页 [查看摘要][在线阅读][下载 1315K] - 兰阿峰;杨曼;郭素芬;刘开辉;邓百万;
[目的]了解野生秦岭羚牛(Budorcas taxicolor bedfordi)瘤胃细菌的组成及其多样性。[方法]提取野生秦岭羚牛瘤胃内容物总DNA,对总DNA进行16S rRNA特异性扩增,构建瘤胃细菌16S rRNA克隆文库,对阳性克隆进行PCRRFLP(限制性内切酶片段长度多态性)分析,并对HaeⅢ酶切带谱不同的菌液进行测序,构建系统发育树。[结果]根据酶切带谱分析和测序结果的不同,将随机挑取的112个阳性克隆归为27个不同的可操作分类单元(OTUs)。系统发育分析表明这些克隆序列主要分布于厚壁菌门(Firmicutes,58.03%)和拟杆菌门(Bacteroidetes,27.68%),另有纤维杆菌门(Fibrobacteres,5.36%)、螺旋体门(Spirochaetes,4.46%)、变形菌门(Proteobacteria,2.68%)、粘胶球形菌门(Lentisphaerae,0.89%)和Synergistetes(0.89%)。未培养菌所占比例高达82.14%。[结论]研究表明野生秦岭羚牛瘤胃内生细菌测序后分为7门27属。
2016年06期 v.26;No.157 581-586页 [查看摘要][在线阅读][下载 903K]
- 姚璐晔;李欣怡;史琦琳;沈博文;沈玉燕;
[目的]以甲醛降解菌宛氏拟青霉菌F1-23为实验菌株,分离纯化得到甲醛脱氢酶的酶液,并考察其酶学性质。[方法]从液体培养液中收集菌体,通过细胞粉碎,采用(NH4)2SO4沉淀、透析、DFAE-Sepharose离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤层析,纯化得到电泳纯的FADH。[结果]该酶的分子量约为112.81 k Da;亚基分子量分别为65k Da和42 k Da;纯酶液活力为336.10 U/mg,较纯化前提高了4.02倍。对该酶的酶学性质分析结果表明,该酶最适反应温度为37℃,在25~45℃时稳定性很好;最适反应p H为8.0,在p H 6.5~8.0范围内酶活力较为稳定。底物特异性研究表明FADH最适底物为甲醛,相对偏好短链醛类。金属离子对酶活性的影响试验表明,Zn~(2+)、Mn~(2+)、Ag~+、Fe~(3+)和Hg~(2+)几乎完全抑制FADH酶活力;Ca~(2+)对酶活有促进作用。纯酶液在4℃环境下,在24h内可保存78%的活性。[结论]FADH结构较为特殊,且活性较大,为后期表达和深入研究其生物学功能提供理论和数据支持。
2016年06期 v.26;No.157 587-592页 [查看摘要][在线阅读][下载 611K] - 张晓杰;徐鸿涛;陈启助;罗利琼;沈娟;廖斌;张军;
[目的]探索不同条件对包涵体复性的影响,优化重组融合蛋白包涵体中释放大环肽的工艺条件。[方法]对纯化后的包涵体进行不同变性液、透析方式及是否超声破碎处理的比较;并在此基础上探讨不同透析温度、谷胱甘肽浓度与L-Arg浓度对大环肽产量的影响。采用Tanon凝胶分析系统与紫外吸收法对大环肽的产量进行分析。[结果]使用8 mol/L的尿素溶解包涵体后,获得的上清液在25℃条件下,在含有1 mmol/L GSH、0.1 mmol/L GSSG、0.8mmol/L L-Arg的透析液中进行梯度透析,其得率为每克包涵体获得约1.4 mg大环肽。[结论]成功从包涵体中获得大环肽并优化工艺条件。
2016年06期 v.26;No.157 593-597+545页 [查看摘要][在线阅读][下载 403K] - 董媛;王会岩;刘微;朱洁;王皓;郭健;于欢;
[目的]以胰岛素信号通路中负调节蛋白PTP1B为靶点,筛选降糖药用真菌。[方法]比较了蛹虫草、蝙蝠蛾拟青霉、桑黄、灰树花4种药用真菌粗提物对PTP1B的抑制活性,并通过糖尿病小鼠模型进行验证。[结果]蝙蝠蛾拟青霉对PTP1B的抑制率最高,达到(78±2.81)%,其抑制类型为竞争性抑制。体内实验显示,蝙蝠蛾拟青霉降血糖效果最佳,小鼠空腹血糖降低了71.2%,与模型组有显著差异(p<0.01),和二甲双胍组相近。蛹虫草组、灰树花组和桑黄组血糖分别降低了62.7%、57.8%和48.3%。此外,各个实验组小鼠的甘油三酯、胆固醇、糖化血红蛋白和胰岛素水平与模型组也存在显著差异。[结论]PTP1B作为糖尿病的新靶标,在筛选降糖药用真菌的过程中也同样适用,而且蝙蝠蛾拟青霉显示了良好的降血糖活性。
2016年06期 v.26;No.157 598-601页 [查看摘要][在线阅读][下载 325K] - 熊明涛;占劲松;朱吉生;邵金辉;
[目的]研究枸橼酸喷托维林对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响。[方法]采用不同浓度(60、75和90μmol/L)的枸橼酸喷托维林处理HepG2细胞48 h,应用MTT(噻唑蓝)法测定细胞的增殖活性,再检测乳酸脱氢酶(LDH)活性,Hoechst 33258染色法检测细胞的凋亡情况。[结果]枸橼酸喷托维林能以浓度依赖的方式抑制HepG2细胞的增殖。对照组与处理组之间LDH活性比较均无显著性差异(P>0.05)。而75μmol/L枸橼酸喷托维林处理48 h能够显著诱导HepG2细胞凋亡。[结论]枸橼酸喷托维林可显著抑制肝癌HepG2细胞增殖,这与其诱导细胞凋亡途径有关。
2016年06期 v.26;No.157 602-605页 [查看摘要][在线阅读][下载 552K] - 黄艳燕;李检秀;刘祺霞;陈先锐;李晓明;陆迪;谢能中;王青艳;
[目的]构建长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体枯草芽孢杆菌工程菌株,优化发酵条件,筛选廉价的培养基原料生产普鲁兰酶。[方法]利用分子生物学手段,将基因pul324和表达载体p WB980连接,构建表达质粒p WB-pul324并转化Bacillus subtilis WB600;对表达产物进行SDS-PAGE分析和初始酶活的测定。进一步优化发酵条件,对不同碳源和氮源进行发酵培养基的筛选,同时研究不同金属离子的添加和培养基初始p H、接种量对发酵产酶的影响。[结果]获得基因工程菌B.subtilis WB600/p WB-pul324,SDS-PAGE电泳结果显示在89 k Da处有特异性条带,发酵初始酶活为12.34 U/ml;筛选得到玉米淀粉水解液和玉米浆干粉为培养基最适碳源和氮源,其最适浓度分别为50 g/L和30 g/L。Mn~(2+)、Fe~(3+)、Fe~(2+)和Tween-80的添加能提高发酵产酶活力。在最适初始p H 6.5,以最适5%接种量接种于优化后的培养基中,摇瓶发酵80 h普鲁兰酶的酶活达到414.48 U/ml。[结论]实现了普鲁兰酶突变体在枯草芽孢杆菌中的高效表达,筛选获得的培养基主要原料经济低廉,经过发酵条件优化后,重组菌酶活达到414.48 U/ml,是之前研究结果(20.16U/ml)的20倍。
2016年06期 v.26;No.157 606-612+592页 [查看摘要][在线阅读][下载 1174K]