- 彭叶龙;乔军;孟庆玲;谢堃;陈诚;刘田莉;马玉;才学鹏;陈创夫;
目的:了解单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)SB5野毒株ncRNA伴侣分子hfq基因及其编码蛋白质的分子生物学特征。方法:利用PCR方法对hfq基因进行扩增、克隆及测序,对hfq基因分子特征进行分析,预测其编码蛋白质的二三级结构及功能活性位点,对其进行同源性及遗传变异分析。结果:LM hfq基因全长234 bp,编码77个氨基酸,对推导的Hfq氨基酸序列分析发现从N端到C端包含1个α-螺旋及5个β-折叠,具有RNA结合位点及六聚体结合位点。LM-SB5 hfq基因核苷酸序列与李斯特菌属各菌株同源率为94.5~100%,与其他种属细菌同源率为36.19~62.39%。结论:Hfq蛋白具有RNA的结合位点,可能在细菌ncRNA调节基因表达过程中发挥重要作用。
2014年04期 v.24;No.143 1-4页 [查看摘要][在线阅读][下载 645K] - 满红涛;郑可欣;徐艳;张梅;马世良;
目的:旨在建立一种简便易行的DNA甲基化文库构建载体,用于筛选细胞中具有甲基化敏感性CCGG位点的DNA片段。方法:根据HpaⅡ/MspⅠ酶切体系对甲基化酶敏感性不同的特点,通过在PCR引物中添加CCGG酶切位点的方法,将扩增得到的目的片段连接到无CpG甲基化的质粒载体上。结果:成功构建了含双CCGG位点的pCpGfree-HpaⅡ/MspⅠ-1质粒载体。结论:所构建的pCpGfree-HpaⅡ/MspⅠ-1质粒载体CCGG位点未发生甲基化,故可以用于构建含有甲基化CCGG序列的DNA甲基化文库。
2014年04期 v.24;No.143 4-10页 [查看摘要][在线阅读][下载 712K] - 李兴暖;王庭;汪涛;刘建云;熊建军;李卫东;
目的:克隆人GNAS1基因编码区序列、构建真核表达载体并瞬时转染Hela细胞。方法:通过RT-PCR克隆GNAS1基因编码序列,亚克隆至pMD19载体,测序鉴定正确后,通过酶切连接至真核表达载体pEGFP-N1,通过菌液PCR和酶切鉴定获得pEGFP-GNAS1重组质粒;表达载体以Lipofectamine2000介导转染Hela细胞,并用实时定量PCR检测外源基因在Hela细胞中的表达。结果:克隆到GNAS1基因并获得了pEGFP-GNAS1表达载体,在Hela细胞中获得了GNAS1的过量表达。结论:成功克隆了GNAS1基因编码序列,并构建其真核表达载体,瞬时转染至Hela细胞,为进一步深入研究Gsα蛋白生物学作用奠定基础。
2014年04期 14-17页 [查看摘要][在线阅读][下载 241K] - 刘彬;蔡惠芬;张依裕;刘若余;罗卫星;
目的:通过筛选3个贵州地方山羊种DQA1基因Exon3的SNPs位点并做相应的遗传变异分析,为今后山羊抗病育种及地方山羊品种的选育提供理论依据。方法:采用构建品种DNA池与直接测序的方法,对三个贵州地方山羊种群共514只个体的DQA1基因外显子3进行遗传变异分析。结果:在3个山羊品种中共筛选得到4个SNPs,G71A(同义突变)、T100C(Asn→Ser)、G202A(Pro→Leu)、A223G(Met→Thr)。生物信息学分析发现,G202A位点变异虽未引起mRNA二级结构的变化,但最小自由能降低,结构稳定性增强;DQA1基因Exon3的不同基因型的蛋白质二级结构中均不含有α螺旋。结论:三个贵州地方山羊种DQA1基因外显子3中含有较丰富的多态性,G202A位点变异在mRNA二级结构及蛋白质二级结构中与其他基因型具有较明显的差异。
2014年04期 17-20页 [查看摘要][在线阅读][下载 533K] - 赵晓飞;刘琼;郭景霞;刘晓娟;曾贝妮;马正海;
目的:在果蝇S2细胞中表达人乳头瘤病毒16型(HPV-16)E1。方法:PCR扩增HPV-16 E1全长,将PCR产物连接至pMD18-T并测序鉴定,继而将HPV-16 E1构建至果蝇表达载体pMT/Bip/V5-HisA中。大量提取pMT/Bip/V5/His-E1重组表达载体并与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,经杀稻瘟菌素(Blasticidin S)筛选获得具有抗性的稳定转染S2细胞。提取稳转S2细胞基因组DNA,PCR鉴定S2细胞中整合的E1。以终浓度为5μmol/L CdCl2诱导表达,收集上清进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果:双酶切及测序结果显示HPV-16 E1基因已克隆人重组质粒pMT/Bip/V5-E1,PCR和Western blot结果表明HPV-16 E1基因已整合至果蝇S2细胞基因组并稳定表达。结论:获得HPV-16 E1转染的果蝇S2细胞株,该细胞株可持续稳定表达E1蛋白。
2014年04期 v.24;No.143 17-20页 [查看摘要][在线阅读][下载 419K] - 汪蕊;刘秀丽;左芳雷;任发政;陈尚武;
目的:构建表达载体pMG76e-nisABTCI,合成重组菌,分析nisin合成基因簇中的nisABTCI超表达对nisin生物合成的影响。方法:将nisABTCI基因克隆与表达载体pMG76e酶切后连接转化,并通过Bio-Rad Gene Pulsor电穿孔法将重组质粒载体转入Lactococcus Lactis N401中,得到重组菌株N401C。对比工程菌和原始产生菌的nisin Z产量。以16S rRNA为内参基因,通过半定量RT-PCR方法,比较分析原始菌株N401和3株重组菌株中nisin合成基因簇中的11个基因的表达情况。结果:成功构建重组菌株,重组菌株的nisin Z产量提高了70%左右。半定量RT-PCR结果表明不同菌株的nisin合成基因的表达表现出了不同的特征。与菌株N401相比,3株重组菌株的大部分基因上调了。结论:nisABTCI超表达明显地提高nisin产量约70%。上调的基因可能对nisin合成效率的提高具有关键作用。
2014年04期 v.24;No.143 20-27页 [查看摘要][在线阅读][下载 1123K] - 范俊;丁月娣;杨润琳;李文新;
目的:构建人生长抑素(somatostatin,SST)不同串联体形式与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白,比较其在毕氏酵母中的表达情况以及生物活性高低。方法:PCR法扩增获得SST14和SST28的二联体和三联体基因,酶切连接形成与HSA的融和基因,并克隆到酵母表达载体pPIC9K中,电击转化毕氏酵母GS115进行高效表达。结果:4种融和蛋白在毕氏酵母中表达水平各不相同,其中(SST28)2-HSA的表达量最高,为200mg/L;(SST14)3-HSA的表达量最低,仅50mg/L;(SST14)2-HSA和(SST28)3-HSA产量居中。药效学分析发现与天然SST-14标准品相比,(SST14)2-HSA药效最佳且具有长效性。结论:融合蛋白(SST14)2-HSA有望弥补SST单体自身半衰期过短的不足,打开SST长效药物发展的新篇章。
2014年04期 31-35页 [查看摘要][在线阅读][下载 376K] - 王烃;郭国光;时健;郝兵;王慧;张守涛;
目的:实现疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus Lipase,TLL)在大肠杆菌中的可溶性表达,并建立有效的纯化方法。方法:根据疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶序列和大肠杆菌密码子的偏爱性,合成了疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶DNA序列,克隆至大肠杆菌表达载体PET-32a(+)中,通过筛选得到阳性重组载体,并转化入大肠杆菌Rosetta(DE3),诱导表达并利用SDS-PAGE电泳检测重组脂肪酶表达情况,并通过Ni柱亲和层析对目的蛋白TLL进行纯化,透析脱盐后,TEV酶切重组融合蛋白,再利用亲和层析纯化得到酶切后的脂肪酶,检测其酶活。结果:得到了可溶性表达的TLL,检测酶切前后脂肪酶的比活性:酶切前达5.7×106U/mg,酶切后达8.9×105U/mg。结论:实现了疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的可溶性表达,并得到有效纯化,同时证明TEV酶切目的蛋白对其活性影响微小,为之后对其进行环化打下基础。
2014年04期 v.24;No.143 31-36页 [查看摘要][在线阅读][下载 358K] - 陈雅婷;郭凯;李敏;赵淑玲;吕孝敏;梁昌镛;
目的:制备苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒PK-1抗体,利用抗体分析PK-1在病毒感染过程中的亚细胞定位。方法:根据pk-1基因序列设计引物,扩增全长序列,将其克隆到原核表达载体pMal-c2x。利用原核表达目的蛋白质,将产物进行亲和层析,获得纯化蛋白。将纯化的融合蛋白免疫兔子制备抗血清,利用PK-1抗血清进行免疫荧光分析PK-1在病毒感染过程中的亚细胞定位。结果:成功原核表达并纯化PK-1融合蛋白,获得PK-1兔多克隆抗血清,并确定了PK-1在病毒的感染过程的亚细胞定位。结论:在杆状病毒感染后的16h,PK-1主要定位在细胞质中,随后扩散到细胞核中,在感染后24h分布在整个细胞中,到感染后48~72h,PK-1又重新定位在细胞质中,这些结果为进一步分析PK-1的功能奠定了基础。
2014年04期 v.24;No.143 36-39页 [查看摘要][在线阅读][下载 205K] - 孟超敏;姬俊华;李雪林;尚家;
目的:运用电子克隆的方法获得小麦中的CPP转录因子基因。方法:以水稻的CPP转录因子作为探针,对小麦的EST数据库进行搜索,应用相关软件进行聚类分析、拼接组装和延长。结果:克隆出4个小麦CPP基因,分别命名为TaCPP1、TaCPP2、TaCPP3和TaCPP4,序列长度分别为977bp、3 022bp、1 582bp和1 156bp,开放阅读框为975bp、2 298bp、720bp和750bp。4个CPP类型蛋白质都具有一个或两个CXC域,而且多数还拥有完整的CRC结构域。结论:4个小麦CPP基因与水稻CPP蛋白具有高度的同源性。研究结果为进一步实验克隆和研究其功能提供了理论基础。
2014年04期 v.24;No.143 39-42页 [查看摘要][在线阅读][下载 1127K] - 刘洪超;李玉秀;邹先明;涂心明;
目的:利用生物信息学方法分析黑腹果蝇CG18853基因编码蛋白的结构和功能。方法:基于NCBI数据库中黑腹果蝇CG18853基因编码蛋白的氨基酸序列,从蛋白质的理化性质、跨膜区、信号肽、亚细胞定位、结构域、三维结构及不同物种间同源蛋白进化关系等方面进行分析。结果:果蝇CG18853蛋白的理论分子量约38.5 kDa,理论等电点为8.80。CG18853蛋白为不稳定亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽,具有DNA光修复酶FAD结合结构域。果蝇CG18853蛋白与模板3umv.1.A有60.87%的氨基酸序列一致;CG18853蛋白与长鼻袋鼠、金鱼、拟南芥、粳稻的编码产物高度同源。结论:黑腹果蝇CG18853蛋白具有DNA光修复酶家族的典型结构,可能在细胞核中参与DNA损伤修复过程。
2014年04期 46-50页 [查看摘要][在线阅读][下载 608K] - 李益;饶妮妮;刘汉明;杨峰;
目的:对新测序菌株Synechococcus sp.PCC 7336的基因组结构分析。方法:利用多种生物信息学工具进行基本信息分析。构建本地比对数据库进行多序列比对分析。构建本地注释数据库进行基因、蛋白质功能分析。基于16S rRNA构建进化树对不同菌株进行聚类并分析进化差异。结果:GC含量为53.7%,共有5 096个蛋白质编码基因,47个RNA基因和不同类型的重复回文序列。与光合作用相关的基因分为9大类,信号传导以"双组分调控系统"为代表,11个次级代谢基因簇合成生物活性物质。进化分析显示其与传统聚球藻菌株差异较大,而与无类囊体蓝藻亲缘关系更密切。结论:Synechococcus sp.PCC 7336是聚球藻属中一个特殊的菌株,在基因组结构、基因数量、进化历程等方面都与其他菌株存在较大差异。
2014年04期 v.24;No.143 46-51页 [查看摘要][在线阅读][下载 472K] - 孙岩岩;罗卫星;谢海强;宋桃伟;刘彬;蔡惠芬;
目的:采用DNA池结合PCR技术,筛选TFB1M基因启动子区SNP位点,并分析其对启动子区的影响。方法:利用多种生物信息学软件预测TFB1M基因核心启动子范围、转录因子结合位点、CpG岛。结果:TFB1M基因启动子区发现1个SNP位点G-234A。TFSEARCH软件预测结果显示TFB1M基因启动子区转录因子ADR1与Sp1位置调换,且ADR1位置的提前导致TFB1M基因转录效率增高。结论:G-234A位点可能影响TFB1M基因转录,试验结果为进一步分析TFB1M基因启动子区功能奠定基础。
2014年04期 v.24;No.143 51-55页 [查看摘要][在线阅读][下载 508K]
- 张环宇;王改平;李晓芳;姚谨;陈倩倩;樊路娟;
目的:构建BRAF和TP53基因多个位点的点突变质粒,为进一步研究其在肿瘤形成中的作用奠定基础。方法:以HEK-293T基因组DNA为模板构建含BRAF600、TP53175和TP53248位点的野生型质粒,利用MutanBESTTM定点突变方法获得含BRAFV600E、TP53R175C和TP53R248W等突变位点的突变型质粒,并进行DNA测序鉴定。结果:DNA测序结果显示构建的三个点突变与实验设计完全一致。结论:成功构建了BRAFV600E、TP53R175C和TP53R248W三个具有不同突变位点的突变型质粒,MutanBESTTM定点突变技术是一种简单、快速、高效的基因定点突变方法。
2014年04期 59-63页 [查看摘要][在线阅读][下载 642K] - 许玉兰;白青松;张瑞丽;田斌;王大玮;何承忠;蔡年辉;康向阳;段安安;
目的:分析基因组微卫星富集文库的序列特征,探索云南松基因组微卫星的分布特征或变异规律。方法:采用磁珠富集法,从云南松基因组DNA的RsaⅠ酶切产物中富集微卫星片段,富集片段经洗脱分离、载体连接及转化等环节,对富集文库鉴定和测序,分析序列特征。结果:在测序获得的159条序列中,有143条序列含有重复次数不少于3次的微卫星序列,序列长度为135~1 138 bp,平均520 bp,克隆比例为89.94%。在这些序列中,以二核苷酸重复类型最多(56.64%),其次是三核苷酸,有51条(35.66%),此外,出现少量(7.70%)重复类型为4~6 bp的微卫星序列;各重复单元的碱基组成以探针及其互补序列为主,并出现少量的非探针类型;重复次数介于3~15,随着重复单元长度的增加而出现的频率降低。结论:分析了云南松基因组微卫星富集文库微卫星重复类型、重复单元碱基组成及其序列长度变异,为进一步分析云南松基因组微卫星的分布特征或变异规律奠定基础,进而为开发SSR引物提供基础信息。
2014年04期 v.24;No.143 62-66页 [查看摘要][在线阅读][下载 330K] - 姚奇;王爱妍;凌敏;
目的:构建鸟分枝杆菌基因组文库。方法:利用16S rRNA基因测序法对15例HIV/AIDS患者痰分枝杆菌培养阳性标本进行菌种鉴定,分离出鸟分枝杆菌。鸟分枝杆菌基因组DNA和pUC19载体经同尾酶Sau3AⅠ和Bam HⅠ分别酶切后连接,连接产物转化大肠杆菌JM109而获得文库。通过计算文库滴度、酶切分析克隆子来评价文库质量。结果:15株分枝杆菌经鉴定,有9株结核分枝杆菌、4株鸟分枝杆菌和2株脓肿分枝杆菌。所构建鸟分枝杆菌基因组文库滴度为2.58×105cfu/ml。随机挑选9个克隆进行Bam HⅠ酶切分析,可见到插入片段大小约在0.5kb~1kb之间。结论:从HIV/AIDS患者中分离出鸟分枝杆菌,并成功构建了鸟分枝杆菌基因组文库,为研究鸟分枝杆菌致病基因的结构和功能提供了基础。
2014年04期 64-66页 [查看摘要][在线阅读][下载 168K] - 魏国荣;李凯瑞;黄雪玲;
目的:建立利用实时荧光定量PCR对玉米黑粉菌[Ustilago maydis(DC.)Corda]快速定量检测的方法。方法:以玉米黑粉菌βactin基因为内参基因,以含有βactin基因的具浓度梯度pMD19 T-Simple质粒为标准品,接种黑粉菌后不同时间点的玉米叶片作为样本用以检验该方法的实用性。结果:建立了利用实时荧光定量PCR对玉米黑粉菌进行定量分析的方法。该方法重复性好、特异性强、灵敏性高,对玉米黑粉菌的最低检出率为19拷贝/反应,可以准确检测经注射接种后1 d的玉米叶片中的黑粉菌量。结论:建立的实时荧光定量PCR方法可用于玉米黑粉菌菌量的检测。
2014年04期 v.24;No.143 66-70页 [查看摘要][在线阅读][下载 325K] - 吴艳玲;夏丽洁;张富春;
目的:电脉冲能够改变细胞膜的通透性,促进外源DNA进入细胞内。通过基因导入仪电脉冲刺激已注入质粒pcDNA3.0-miR-122的小鼠肌肉细胞,检测对小鼠miR-122表达的影响。方法:将扩增得到的pre-miR-122克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,构建pcDNA3.0-miR-122表达质粒。利用基因导入仪分别将生理盐水、pcDNA3.0、pcDNA3.0-miR-122质粒DNA导入小鼠腿部肌肉,然后进行电脉冲刺激。qRT-PCR测定各组小鼠血清及肝脏中的miR-122水平,同时检测肝癌组织和经Cecropin XJ处理的肝癌组织中的miR-122水平。结果:基因导入仪电脉冲刺激已注入pcDNA3.0-miR-122的腿部肌肉组织后,小鼠血清和肝脏中miR-122的表达分别提高了23和11倍,经Cecropin XJ处理的小鼠肝癌组织中miR-122的表达比对照高1.6倍。结论:电脉冲刺激能够显著提高小鼠体内miR-122的表达,为探讨miR-122表达对肝癌生长影响的调控作用奠定基础。
2014年04期 75-79页 [查看摘要][在线阅读][下载 293K] - 成娟丽;李锋;王红;林金水;
目的:分析设计抗菌肽MagaininⅡ多拷贝串联体表达质粒并进行构建验证。方法:根据GeneBank中提供的抗菌肽MagaininⅡ氨基酸序列,结合表达菌株毕赤酵母密码子偏爱性,设计出MagaininⅡ的表达序列,并于其两端插入一对同尾酶SalⅠ和XhoⅠ的酶切识别序列及裂解位点AGA,人工合成后插入质粒载体pUC19中,利用同尾酶法构建抗菌肽MagaininⅡ多拷贝串联体。结果:经M13引物进行PCR及SalⅠ/PstⅠ双酶切进行鉴定,成功构建出抗菌肽MagaininⅡ1-5拷贝串联体重组质粒。结论:该研究设计的MagaininⅡ串联体构建方法可行。
2014年04期 v.24;No.143 75-79页 [查看摘要][在线阅读][下载 477K] - 谢海强;孙岩岩;龚俞;焦仁刚;盘道兴;杨永强;刘若余;
目的:探讨STAT5A基因SNP与贵州黑山羊生长性状关联性,旨在为山羊选种选育提供更好的科学依据。方法:以贵州黑山羊为研究对象,采用DNA池法及PCR-SSCP技术检测STAT5A基因单核苷酸多态性。结果:贵州黑山羊STAT5A基因内含子6和外显子7分别检测到1个SNP位点T-90C和C+69T,位点T-90C为2种基因型,分别命名为CC和TC。基因型与生长性状关联分析显示,贵州黑山羊TC基因型个体的胸围显著高于CC基因型个体(P<0.05),而其余4个指标均差异不显著(P>0.05);实验山羊群体基因频率和基因型频率处于哈代-温伯格平衡状态(P>0.05)。结论:研究结果提示:STAT5A基因可能是影响山羊胸围的主效基因或与主效基因连锁,T-90C位点可望作为提高山羊个体生长性能的分子遗传标记。
2014年04期 83-87页 [查看摘要][在线阅读][下载 346K] - 马元伟;刘宇;马康;许峰;王守现;王兰青;
目的:鉴定一株从采自北京市房山区的野生血红铆钉菇中分离得到的丝状真菌,分析其遗传地位,为进一步研究该菌株与血红铆钉菇的关系奠定基础。方法:以血红铆钉菇为材料,进行了组织分离,获得1株丝状真菌菌株,编号为JZB2120006,对其进行了形态学鉴定,并提取了基因组DNA,进行了ITS片段的扩增、测序及系统发育分析。结果:分子生物学鉴定结果表明,该菌株与Penicillium sclerotiorum ZZ07-5菌株有99.3%的同源性。结论:结合形态学特征将该菌株鉴定为P.sclerotiorum,ITS基因序列GenBank登录号为KC594044。
2014年04期 87-90页 [查看摘要][在线阅读][下载 516K]