- 方志锴;洪文荣;严凌斌;
目的:建立金色链霉菌基因敲除体系,敲除金色链霉菌J13中的ctcF基因,研究工程菌的代谢变化。方法:采用基因置换和框内缺失技术,对ctcF基因进行敲除。结果:利用接合转移的方法,将质粒pFD109导入到金色链霉菌J13中,经抗性筛选及PCR验证获得ctcF基因置换菌株金色链霉菌A1-20;将质粒pFD111经接合转移导入到A1-20中,获得ctcF基因框内缺失菌株金色链霉菌K2-46;以上工程菌的发酵组分经HPLC分析,发现金霉素发酵单位显著降低。结论:获得的接合子发生双交换的概率可达18%以上,建立及验证了金色链霉菌基因敲除体系的实用性和可操作性,并初步推测ctcF为金霉素生物合成中的调控基因。
2011年06期 3-6页 [查看摘要][在线阅读][下载 307K] - 孙桂平;杨帆;李卫星;展蔷;程立宝;
目的:利用同源克隆法从垂丝海棠(Malus halliana(Voss.)Koehne.)中克隆到花色素苷合成相关酶DFR(二氢黄酮醇-4-还原酶)基因,这为进一步研究基因表达和基因功能奠定基础。方法:采用CTAB法提取垂丝海棠叶片总RNA,通过RT-PCR克隆得到DFR基因。结果:得到一个长度为1 181 bp的DFR基因,该基因编码394个氨基酸残基,通过数据库进行比对分析,表明实验得到的DFR基因和其他植物中的DFR基因在编码的氨基酸上具有很高的同源性,因此命名为MhDFR,另外MhDFR与观赏海棠"王族"的McDFR在进化上亲缘关系最近近。结论:通过MhDFR的克隆,为进一步研究色素的合成及代谢奠定基础。
2011年06期 v.21;No.127 5-9页 [查看摘要][在线阅读][下载 1252K] - 朱碧云;高蓝;李浩明;
目的:研究生物乙醇发酵关键酶丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase,PDC)的性质和功能。方法:从SMART技术构建的红曲霉(Monascus anka CICC 5031)cDNA文库中筛选pdc基因,亚克隆到表达载体pET-21b(+),原核表达、亲和层析纯化重组PDC。分析重组PDC和野生型PDC的酶学性质。结果:pdc基因的开放阅读框长1 713bp,编码一个570个氨基酸残基的蛋白质。重组PDC在E.coli BL21(DE3)中的表达量为菌体总蛋白的32.7%。重组PDC与野生型PDC比活分别为20.2U/mg和30.1U/mg。二者的最适反应条件均为pH6.0、30℃。重组PDC和野生型PDC的Km值分别为2.6mmol/L和0.56mmol/L。结论:红曲霉pdc基因可在大肠杆菌中高效表达,重组PDC稳定性较好,可用作生物乙醇生产的候选资源。
2011年06期 v.21;No.127 9-14页 [查看摘要][在线阅读][下载 288K] - 于永生;曹阳;罗晓彤;张树敏;
目的:构建肌肉特异性表达线虫ω-3脂肪酸去饱和酶的肌肉特异性载体,证明其表达的有效性。方法:化学合成292bp的带有肌肉特异性转录因子结合位点的DNA序列,然后与线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成肌肉特异性表达载体pcDNA3.1-SF,4w龄C57BL/6小鼠肌肉注射该重组载体,RT-PCR检测证明其表达有效性。结果:DNA测序结果证明合成的292 bp片段带有肌肉特异性表达元件;PCR鉴定显示启动子片段正确地插入到目的基因上游;RT-PCR鉴定显示肌肉内ω-3脂肪酸去饱和酶基因得到有效转录。结论:该试验为在转基因动物的肌肉中表达外源基因奠定了基础。
2011年06期 v.21;No.127 14-17页 [查看摘要][在线阅读][下载 678K] - 朱爱华;夏文静;黄赛男;季卫丹;吕爱军;
目的:克隆小鼠热休克蛋白60(HSP60)基因,在大肠杆菌中表达,并进一步对其表达条件进行优化。方法:采用RT-PCR技术克隆出非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠HSP60的cDNA序列。构建重组表达载体pET28a-HSP60,以其转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),在不同的菌体浓度、不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、不同诱导时间以及不同温度条件下诱导,检测重组蛋白的表达情况。结果:获得一个含有1 721bp的cDNA的片段,重组蛋白HSP60在E.coli BL-21(DE3)中的最佳表达条件是菌体密度A600nm为0.6,诱导时间为5h,诱导物(IPTG)浓度为4mmol/L,诱导温度为35℃,重组蛋白大小约为60kD。结论:成功克隆了小鼠HSP60基因,并在大肠杆菌中获得高效表达,为重组蛋白的分离纯化及进一步研究其生物学功能奠定了基础。
2011年06期 v.21;No.127 17-20页 [查看摘要][在线阅读][下载 309K] - 谢琪璇;罗峰;秋山泰身;井上纯一郎;秦俊文;
目的:构建小鼠TRAF6基因特异性shRNA慢病毒质粒。方法:设计、合成小鼠TRAF6基因特异性shRNA核苷酸,将其链接入pENTR/U6载体,基因测序;通过LR克隆酶将pENTR/U6中的TRAF6特异性shRNA核苷酸插入CS-RfA-EG慢病毒载体,KpnⅠ限制酶切分析;通过慢病毒将TRAF6基因特异性shRNA慢病毒质粒导入MEF13细胞中,FACS分析质粒导入率,同时利用Western blot技术检测MEF13细胞中TRAF6的表达以及磷酸化IκBα的表达。以LacZ基因特异性shRNA慢病毒质粒为对照。结果:构建的小鼠TRAF6基因特异性shRNA慢病毒质粒与设计相符;MEF13细胞中慢病毒质粒的导入率为95%以上;与对照组比较,TRAF6基因特异性shRNA可长期、完全抑制MEF13细胞中TRAF6的表达及TRAF6介导的IκBα的磷酸化。结论:成功构建小鼠TRAF6基因特异性shRNA慢病毒质粒。
2011年06期 v.21;No.127 20-24页 [查看摘要][在线阅读][下载 377K] - 张泽华;杨穗珊;张爱联;
目的:用pGAP启动子在P.pastoris中组成型表达漆酶。方法:用PCR从枯草芽孢杆菌基因组中扩增漆酶基因lac2。用NotⅠ和EcoRⅠ双酶切将lac2基因重组于表达载体PGAP9K。通过电转法将其转化于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性以及高表达Lac2酶的重组子作为工程菌Gs115(pGAP9k-lac2)。用甘油作为碳源在50L生物反应器中表达重组漆酶Lac2。用ABTS法测定发酵液中的漆酶活力。结果:在发酵30h时,其Lac2酶的表达达峰值,其活性为136.67U/L。其峰值的Lac2酶的表达量为50mg/L。表达产物具有分解ABTs的活性。结论:成功克隆了漆酶基因lac2,并首次实现用pGAP启动子在P.pastoris中组成型表达漆酶,为用P.Pastoris规模化生产漆酶奠定了基础。
2011年06期 26-29页 [查看摘要][在线阅读][下载 319K] - 高武军;张宏杰;王孝娟;邓传良;卢龙斗;
目的:开发新型石刁柏EST-SSR分子标记和开展相关的分子生物学研究。方法:利用EST-trimmer、Repeat Masker、SSRIT等生物信息学分析工具对石刁柏EST数据库中的EST序列进行去除poly A/T尾,载体、重复序列和低质量序列处理,并对EST序列中SSR分布特征进行了分析。结果:在NCBI数据库中下载的8 565条石刁柏EST序列中,重复次数超过5次的SSR共有610个,其中分布于601～800bp的EST-SSR标记最多,共464个,占SSR总数的77.33%;主要SSR重复基元类型是二核苷酸,共426个,占SSR总数的69.84%,其次是三核苷酸占SSR总数的29.18%。四核苷酸和五核苷酸的SSR仅各3个。结论:石刁柏EST中存在丰富的SSR信息,其中二核苷酸的AG/TC、GA/CT以及三核苷酸的CTT/GAA是SSR主要的重复单元。
2011年06期 v.21;No.127 27-31页 [查看摘要][在线阅读][下载 335K] - 仇有文;高学军;张明辉;敖金霞;袁肖寒;刘营;
目的:确定抗除草剂转基因大豆外源基因拷贝数和其插入位点侧翼序列。方法:采用绝对定量PCR法测定转EPSPS基因大豆中外源基因拷贝数,内参照基因标准曲线选用大豆凝集素(Lectin)基因为标准品,外源基因标准曲线以含EPSPS基因的阳性质粒为标准品。采用基因组步移技术和巢式PCR方法确定抗除草剂转基因大豆插入位点旁侧序列。结果:抗除草剂转基因大豆外源基因的拷贝数为1。CaMV35S上游扩增887bp,NOS下游扩增1 340bp。结论:明确了EPSPS外源基因在转基因大豆中为单拷贝,转基因大豆插入位点附近大豆基因组发生了DNA重排。
2011年06期 v.21;No.127 31-35页 [查看摘要][在线阅读][下载 787K] - 马丽娜;刘志刚;宋兵;彭元;蔡继业;金花;陈辉;
目的:研究华蟾素诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡过程中,细胞内活性氧(ROS)及线粒体膜电位(△Ψm)的变化,探讨华蟾素对乳腺癌细胞的作用机制。方法:用不同浓度的华蟾素作用于MDA-MB-231细胞24h后,分别用荧光探针罗丹明123和荧光探针DCFH-DA进行荧光染色,用流式细胞仪检测细胞内线粒体膜电位和活性氧的变化。结果:不同浓度的华蟾素作用于MDA-MB-231细胞后,随着药物浓度的增加(0、12.5、25、37.5、50μg/ml),细胞内的ROS水平显著升高,荧光强度从3 609±24上升为6 263±35;同时,线粒体膜电位(△Ψm)显著下降,荧光强度从242±6降低到173±4。结论:华蟾素作用细胞后,使得细胞内活性氧水平显著升高,同时,线粒体膜电位显著下降,推测华蟾素对MDA-MB-231细胞通过线粒体途径诱发细胞凋亡。
2011年06期 37-40页 [查看摘要][在线阅读][下载 404K]
- 杨瑞;李小英;王天云;
目的:探讨多样本、多基因的单核苷酸突变基因分型操作的PCR-SSP的最优参数,建立最佳反应体系。方法:优化PCR-SSP反应中扩增体系参数,选取优化后的参数做为反应体系;在反应体系已优化的条件下,分别优化解链温度、循环参数。结果:优化后Mg2+、dNTPs、Taq酶、序列特异性引物、内对照引物、DNA模板在20μL反应体系中的终浓度分别为:3.75μmol/L、0.5m mol/L、2.5U、0.5μmol/L、0.2μmol/L、0.15μg;采用改良的TouchDown做为循环参数,其中DNA变性时间至15min,增加5个起始循环。结论:成功建立了PCR-SSP反应的快速操作体系,扩增条带清晰,普通、琼脂糖凝胶电泳即可检测单核苷酸突变基因型。优化后的体系适合对人、小鼠等各类型DNA样本进行快速多基因单核苷酸多态性分型。
2011年06期 v.21;No.127 39-43页 [查看摘要][在线阅读][下载 350K] - 宋桃伟;李敬瑞;刘若余;陈云华;吴仲超;
目的:分析猪GH基因启动子区序列的多态性,期望筛选出对猪生长性状有显著影响的SNP位点,为地方猪种的选育及选种提供一定的理论依据。方法:以大约克、可乐猪、香猪和黔北黑猪为试验对象,构建品种DNA池,采用PCR产物直接测序法对猪GH基因启动子区-856～+171片段共1 027bp进行单核苷酸多态性检测。结果:除香猪外,在其他3个猪种5`-端侧翼序列发现5个SNP位点:C22T、A-26T、G-219A、T-385A和C-391T,并且在大约克GH基因启动子区-640处发现了一个12bp碱基序列(GGCAAAGTGTAG)的缺失。结论:DNA池结合PCR产物直接测序技术能够很好的筛选SNP位点,本研究采用该技术在猪GH基因启动子区-856～+171片段检测到了5个SNP位点。
2011年06期 v.21;No.127 43-46页 [查看摘要][在线阅读][下载 223K] - 周鹤峰;邵敏;吴惠兴;尹鉴;姬可平;
目的:采用RAPD技术对木兰科10属17种植物进行遗传多样性分析。方法:采用改良CTAB法提取基因组DNA,用筛选的9个引物的RAPD结果进行聚类分析,得出17种木兰科植物的聚合树状图。结果:9条RAPD引物共扩增出346条清晰稳定的条带,其中有295个多态性位点,多态百分比为85.3%,聚类分析表明,在遗传距离为0.728处17个供试品种分为3个类群。结论:中国木兰科植物品种有丰富的遗传多样性,RAPD技术可以用于木兰科植物的种间鉴别和遗传学研究。
2011年06期 v.21;No.127 46-49页 [查看摘要][在线阅读][下载 281K] - 李传宝;华甜;金海明;杜宏武;
目的:探究电激和普鲁卡因对DNA导入哺乳动物活体效率的影响。方法:向小鼠的股四头肌注射20μgβ-gal质粒,分别采用以下方法:直接注射;先注射100μL 0.25%的普鲁卡因,24 h后注射质粒;注射质粒后进行经过前期优化后的电激程序进行加强(500 V,4个脉冲)。注射后的第2 d、1w和2w后进行x-gal染色检测。结果:三种导入方法均可将外源质粒导入肌肉组织中并进行表达。电激和普鲁卡因可以显著增强肌肉对外源基因的吸收和表达,尤其是优化后的电激程序,其可以使肌肉长期稳定高效的表达外源导入基因。结论:普鲁卡因是常用的增强DNA导入效率的促进剂,而合适的电激可以更为显著地增强DNA导入效率,均是基因治疗中提高基因导入效率的良好候选方案。
2011年06期 v.21;No.127 49-52页 [查看摘要][在线阅读][下载 590K] - 江树勋;郎春燕;邵碧英;陈洪俊;陈文炳;潘大仁;
目的:通过筛选获得CP4-EPSPS转基因蛋白的最优适体,为应用于检测作准备。方法:体外合成长度为78个碱基的随机ssDNA文库,应用指数富集配基的系统进化(SELEX)技术,以CP4-EPSPS转基因蛋白为靶目标进行15轮筛选,将筛选到的适体群进行克隆、测序,用DNAMAN软件对每个适体的保守序列和二级结构进行分析并应用生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统进行亲和性分析。结果:成功获得靶目标的最优适体,即D04号适体,结合率最高(2.2745)为最低的5.9倍。结论:筛选流程合理、可行,实验结果较理想。
2011年06期 v.21;No.127 53-57页 [查看摘要][在线阅读][下载 1199K] - 梅运军;陈锦;沈萍;
目的:用简单易行的诱导手段,从溶源性的嗜盐古生菌中诱导产生新的噬菌体,为分离嗜盐古生菌噬菌体提供一种新的途径。方法:分别用紫外线与丝裂霉素C对10株对数期的嗜盐古生菌菌株进行诱导,上清液采用双层平板法进行噬菌斑鉴定,并用脉冲场凝胶电泳对噬菌体基因组进行分析。结果:经1μg/mL丝裂霉素C诱导的嗜盐古生菌融合子F5产生了一株新的嗜盐古生菌噬菌体SNJ1,该噬菌体能感染Natrinema属的菌株J7。结论:丝裂霉素C能诱导原噬菌体从宿主中分离,为嗜盐古生菌噬菌体分离提供了一条新的途径。
2011年06期 v.21;No.127 57-60页 [查看摘要][在线阅读][下载 284K] - 苏良辰;肖婷;李玲;
目的:研究AhAO2基因对拟南芥抗旱生理的影响。方法:以转AhAO2基因拟南芥(AO2-1-4、AO2-3-7、AO2-8-1)为实验材料,通过植物根长、相对含水量、气孔开度和抗氧化酶比活力指标的综合评定,分析超表达AhAO2基因对拟南芥抗旱生理的影响。结果:在PEG胁迫下,AO2-1-4、AO2-3-7、AO2-8-1植株体内相对含水量分别比野生型高2.1%、1.3%和1.6%;超表达植株AO2-1-4、AO2-3-7、AO2-8-1抗氧化酶POD酶比活力较野生型提高73.1%、66.2%和74.4%,SOD酶比活力较野生型提高64.6%、80.5%和43.1%。而野生型的气孔开度在正常生长和PEG胁迫的条件下均低于超表达拟南芥株系。AhAO2转基因植株可能通过提高抗氧化酶活性提升了抗旱能力。
2011年06期 v.21;No.127 60-63页 [查看摘要][在线阅读][下载 367K]
- 陈立佼;柴红梅;黄兴奇;赵永昌;
目的:羊肚菌不同分离物在培养过程中形态学变化较大且极不稳定,通过同一子实体不同单孢菌株在不同培养基上的培养特性研究特别是产菌核能力的变化回答这些变化是否是由于多核菌株的不稳定性引起。方法:以不同来源尖顶羊肚菌单孢菌株为材料,并以粗柄羊肚菌为对照,研究了菌株在不同培养基上的培养特性,并对同一子实体及不同子实体产菌核和不产菌核单孢进行配对培养。结果:尖顶羊肚菌单孢菌株按培养特征可分为9类,同等条件下每一菌株的培养特性保持稳定;在综合马铃薯葡萄糖培养基(CPDA)、葡萄糖硝酸钠琼脂培养基(GN)、酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)进行转接培养时,可成功地将产菌核菌株转化为不产菌核菌株;尖顶羊肚菌同一子实体及不同子实体各产菌核单孢菌株产核数量及分布变化很大,交配后单孢之间性状会发生较大变化,包括菌核形态、菌丝形态、生长势,特别是产菌核能力会消失和发生转移。
2011年06期 v.21;No.127 63-70页 [查看摘要][在线阅读][下载 668K] - 吴祖芳;张泽瑞;翁佩芳;
目的:从自然界中分离光合细菌,对其代谢氮磷硫的特性进行初步研究,为其在畜禽废物净化等应用奠定基础。方法:采用厌氧培养法富集、半固体试管法和双层平板法选择性筛选光合细菌,得到了3株光合细菌分别记为psb-L、psb-H和psb-S。在富集培养基中分别添加KH2 PO4、Na2 S和以KNO3作唯一无机氮源进行培养,研究试验菌株对氮、磷、硫化合物的代谢能力。结果:在设计的培养基中,3株光合细菌psb-L、psb-H和psb-S都能生长;经培养4d后对磷酸盐的代谢率分别为15.80%、13.49%和13.01%;经培养6d后对硫化物的代谢率分别为46.58%、32.88%和39.18%;培养17d后对硝酸盐的代谢率分别达到96.38%、89.31%和90.04%;为进一步应用于畜禽废物发酵提供参考依据。
2011年06期 v.21;No.127 70-74页 [查看摘要][在线阅读][下载 161K] - 李勇超;成元刚;黄恩发;杨靖;孟丽;
目的:获得快速检测发酵液中10-DAB含量的方法。方法:以产10-DAB内生真菌的发酵液为材料,比较TLC的三种展开系统:丙酮-石油醚、正己烷-氯仿-乙酸乙酯-甲醇-三乙胺和环己烷-乙酸乙酯,及成分的不同比例关系对10-DAB展开效果的影响,再以HPLC进行检测验证。结果:先浓缩发酵液,再以丙酮:石油醚=4:1作为展开剂,乙醇:浓硫酸=9:1为显色剂,最小检测限为0.3μg。结论:该检测方法快速准确,为培育和改良产10-DAB菌种以及发酵生产10-DAB奠定基础。
2011年06期 76-79页 [查看摘要][在线阅读][下载 357K] - 黄琳;刘逸寒;王春霞;王建玲;杜连祥;路福平;
目的:对一株产青霉素酶的重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis DB104/pWB-pemp)的摇瓶发酵条件进行优化。方法:利用单因素实验及正交实验等方法考查重组菌摇瓶发酵条件,研究不同浓度的碳源、氮源、金属离子、磷酸盐及不同pH、接种量、装液量和温度等条件对产青霉素酶的影响。结果:重组菌株摇瓶最适发酵条件为pH 7.0、接种量3%、装液量14%、发酵温度37℃,培养基成分为2%蔗糖、3.5%酵母膏、0.1mmol/L镁离子、0.4%磷酸盐。结论:最优条件下,发酵36h,产酶活力达到2227.8U/mL,为先前研究结果(1 580 U/mL)的1.41倍,为重组菌的大规模发酵生产奠定了基础。
2011年06期 79-82页 [查看摘要][在线阅读][下载 154K] - 虞凤慧;徐泽平;杨传伦;张心青;王秀芝;黄宝生;周传兵;
目的:研究灰树花(Grifola frondosa)蛋白聚糖的提取与分离方法及氨基酸组成。方法:采用碱提法提取蛋白聚糖,QSepharose FF离子交换层析进行纯化,SDS-PAGE电泳分离蛋白聚糖及结合蛋白,高效液相色谱法鉴定蛋白聚糖的纯度及分子量,并测定18种氨基酸的含量。结果:分离出蛋白聚糖GFPⅠ、GFPⅡ和GFPⅢ,糖含量分别为:43.69%、40.88%、28.33%,蛋白含量分别为:40.42%、34.65%、51.19%。其中GFPⅢ为均一成分,纯度93.61%,重均相对分子量(Mr)150kDa,GFPⅢ结合蛋白分子量约为33.0kDa,为单一谱带。氨基酸组成分析结果显示:GFPⅢ的氨基酸总和达到66.60g/100g,其中8种必需氨基酸总量为26.14g/100g,4种呈味氨基酸总量为25.43g/100g,Asp、Glu、Leu、Ala和Lys含量较高。结论:分离出的蛋白聚糖为结构均一成分,纯度较高,可用于质量研究和生物学研究。
2011年06期 v.21;No.127 80-84页 [查看摘要][在线阅读][下载 206K] - 蔡旋;陈小连;杨帆;徐建雄;谷娟;张超;
目的:研究微生物源性抗氧化剂的体外抗氧化能力。方法:在体外分别测定微生物源性抗氧化剂、α-生育酚(VE)、抗坏血酸(VC)、L-硫辛酸、表没食子酸儿茶素的还原能力,羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基清除能力及抗脂质过氧化能力,比较微生物源性抗氧化剂与其他抗氧化剂抗氧化能力。结果:微生物源性抗氧化剂有较强的抗氧化能力,体外清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基能力的半数有效量(EC50)分别为184.5μg、48.7μg、66.1μg。与常见抗氧化剂相比,微生物源性抗氧化剂对氧自由基及氮自由基都有较好的清除自由基作用。结论:微生物源性抗氧化剂体外抗氧化作用明显,有进一步开发的价值。
2011年06期 86-89页 [查看摘要][在线阅读][下载 177K]